Ανάπτυξη ζωικών προτύπων ανθρώπινων ασθενειών μέσω ιστο-ειδικής μειορρύθμισης γονιδίων ελέγχου ενδοκυτταρικών σηματοδοτικών δικτύων στο δίπτερο έντομο Drosophila melanogaster

Abstract

The mechanisms that control “organismal” growth and its coordination with the availability of nutrients, in the cellular micro-environments, were unknown until a few decades ago. It is now widely accepted that the “mechanistic target of rapamycin” mTOR functions as a major nutrient sensor and a fundamental regulator of animal growth, and plays a central role in physiology, metabolism, aging, and disease. Its dysregulation has been strongly associated with several human disorders, including diabetes, neurodegenerative diseases, and cancer. mTOR is an evolutionary conserved serine/threonine protein kinase and is the catalytic core of two large multi-protein complexes named mTORC1 (mTOR complex 1) and mTORC2 (mTOR complex 2). Their function, substrate specificity, upstream inputs, downstream outputs, and sensitivity to rapamycin differ notably due to the distinct composition of their accessory proteins. mTORC1 is better characterized and reviewed out of the two mTOR complexes. It controls cell growth and metabolism by regulating anabolic and catabolic processes, including protein, lipid, and nucleotide synthesis. mTORC1 also blocks autophagy in response to various environmental cues, such as growth factors, energy status, oxygen, stress, and especially amino acids. One of the key regulators of mTORC1 is the heterotrimeric protein complex TSC (Tuberous Sclerosis Complex). The TSC1 and TSC2 proteins bind to the TBC1D7 component and form the functional TSC complex, which is also the major suppressor of the mTORC1-complex activities. Mutations in the TSC1 and/or TSC2 genes are responsible for the onset of Tuberous Sclerosis in humans. Tuberous Sclerosis is an autosomal dominant genetic disorder characterized by the presence of benign tumors in multiple organ systems. It is remarkable that mutations in the TSC1 and TSC2 genes are responsible for ~85% of patients, while ~15% of those with diagnosed Tuberous Sclerosis do not have any detectable mutations in either of the two genes. The aim of this PhD Thesis is to develop an innovative biological platform that will reliably and efficiently reproduce Tuberous Sclerosis, using as animal model Drosophila melanogaster. D. melanogaster represents one of the most powerful model organisms, and due to its unique advantages, it is used worldwide in biological research, by numerous laboratories, as experimental model, to elucidate important issues concerning the molecular mechanisms of development, differentiation, and aging. By using advanced bioinformatics tools and freely available databases, such as "FlyBase" (flybase.org), "Ensembl Genome Browser 91" (ensembl.org), and "BLAST-NCBI-NIH" (ncbi.nlm. nih.gov/BLAST), we identified in silico the homologous genes of TSC1, TSC2 and TBC1D7 in Drosophila (dTSC1, dTSC2 and dTBC1D7), and achieved silencing of their (post-)transcriptional/translational expression, with the GAL4/UAS genetic tool and RNAi technology, in multiple different tissues. The observed phenotypes of control and genetically targeted flies were evaluated by light (stereo)microscopy and scanning electron microscopy (SEM).Organismal neurological/neuronal/neuromuscular integrity was assessed by examining survival profiles and negative geotaxis patterns in both control and genetically targeted flies, during aging. Flies with reduced dTSC1 and dTSC2 protein expression, specifically in the nervous system, being characterized by strong pathologies, were further selected for brain micro-anatomy and whole-cell protein isolation. Western blotting was performed for examination of possible activation, through phosphorylation, of dTOR downstream effectors, such as the dS6K1 and d4EBP1 target proteins. Most importantly, control fly populations and transgenic flies typified by RNAi-mediated targeting of the dTSC1 or dTSC2 gene, specifically in neuronal tissues, were thoroughly mapped (and quantified) for their proteome (via advanced nano-LC-MS/MS technology), transcriptome (via state-of-the-art RNA-Seq. technology) and metabolome (via new generation LC-MS/MS technology) contents, and they were also subjected to large-scale profiling of their active kinome components, through the novel and innovative PamGene technology application. Gut bacteria are tightly associated with various functions and specific diseases, and the microbiome can influence host physiology and metabolism. Therefore, bacterial DNA was isolated from (mid-)gut tissues of dTSC1 or dTSC2 downregulated flies [specifically in the (mid-)gut], and microbiome analysis was performed, compared to control crosses. Interestingly, mTOR inhibitors and autophagy (suppressed by activated mTORC1) inducers were suitably administered to TSC-targeted flies carrying the strongest pathogenic phenotypes, to reverse brain pathology and to develop a new chemotherapeutic in vivo platform for Tuberous Sclerosis management and treatment in the clinic. Downregulation of the dTSC1 or dTSC2 gene specifically in Drosophila’s eye, resulted in altered morphology from a young age (10 days), with progressive loss of cilia, during senescence. On the other hand, downregulation of the dTBC1D7 protein in fly’s eye did not cause any pathological phenotype. Wing structure and architectural organization was strongly altered in dTSC1- or dTSC2-downregulated flies, with the observed phenotypes varying. Downregulation of the dTBC1D7 protein did not affect wing’s morphology, however was observed an increased on the average wing surface area in dTBC1D7-targeted male flies, compared to control ones. Longevities of both dTSC1-targeted female and male flies were remarkably reduced compared to control conditions, in all examined organ systems (nervous system, giant neuron system, cholinergic/dopaminergic/glutaminergic/serotonergic/γ-amino- butyric neurons, interneuron, motor neurons, muscle, gut) except glial cells, whereas there weren’t notable changes. dTSC1 downregulation affected Drosophila’s climbing capacity, which was reduced, in both sexes, (dopaminergic and γ-aminobutyric neurons are excluded), and the strongest and most pathological phenotype was observed after downregulation of dTSC1 gene in the neuronal system and in the giant fiber system, a fact that was also confirmed through electrophysiology. Exogenous administration of the dTOR kinase inhibitor, Ridaforolimus, to dTSC1-targeted flies especially in the nervous system, caused a significant improvement in female flies’ life expectancy. Downregulation of the dTSC2 gene resulted in altered viability and climbing ability, in a sex- and tissue-dependent manner. Survival of female flies was statistically significant reduced following dTSC2 gene silencing in the nervous system, giant neuron system, cholinergic/dopaminergic/glutamanergic and γ-aminobutyric neurons, interneuron, motor neurons, and gut tissue. Viability of dTSC2-gene targeted male flies in cholinergic/dopaminergic/glutamanergic, γ-aminobutyric neurons as well as in glial cells was impaired, compared to control conditions. Female transgene flies showed motor dysfunction after downregulation of the dTSC2 protein in the nervous system, in giant neuron system, in glutamatergic and motor neurons as well as in glial cells. Climbing ability appeared reduced in most of the examined tissues of dTSC2-targeted male flies. The administration of the dTOR kinase inhibitors, Ridaforolimus and Everolimus, as well as the autophagy inducer Spemidine, to insects with downregulation of the dTSC2 gene in the nervous system, due to the strong motor difficulty they displayed, caused a significant increase in the locomotor performance of male flies, compared to backgrounds without the chemical elements. Mapping of the metabolome, proteome and active kinome in fly populations with dTSC1 or dTSC2 gene silencing in the nervous system, revealed a series of novel biomarkers. Investigating the activation of kinases in Drosophila’s dTSC1 or dTSC2 downregulated brains, exposed a significant increase in the activity of various kinases, including substrates of the dTORC1 complex, such as dp70S6K. In terms of metabolomic analysis, dTSC1 gene silencing, which leads to dysregulation of the dTOR signaling network, resulted in a significant increase in the metabolite betaine, a sugar involved in methionine metabolism, while dTSC2 gene silencing led to an increase of the disaccharide trehalose. Transcriptome analysis of transgenic flies with neuronal downregulated dTSC1 gene expression, showed the transcriptional activation of genes related to D. melanogaster’s immune system activity. Finally, analysis of the microbiome in both dTSC1 and dTSC2 gene silencing flies in midgut tissues, uncovered meaningful differences in microbial cargo between transgenic and control populations. The results obtained by dTBC1D7 protein downregulation show that the absence of this protein has the opposite effect compared to dTSC1 or dTSC2 protein loss. Specifically, the lifespan profiles of female transgenic flies in the nervous system, glutamatergic and motor neurons, muscles and intestine, were significantly improved compared to healthy backgrounds, while in male populations there was an increased life expectancy in all tissues studied, except the nervous system. The kinetic capacity of dTBC1D7-targeted female flies did not show significant alterations compared to control conditions, while in males was observed a tendency to decreased locomotor activity in cholinergic, serotonergic and motor neurons, in glial cells, muscles and midgut tissues. Finally, was investigated the role of SAMTOR protein, a protein that indirectly signals methionine levels to the mTORC1 complex. Strong dSAMTOR protein downregulation in different organ systems (whole body, nervous system, motor neurons, muscle, glial cells) resulted in non-viable phenotypes, while strong dSAMTOR gene silencing in eyes and wings caused severe loss of cilia and dysmorphic wings, respectively. Survival rates of strong dSAMTOR RNAi-mediated flies of both sexes, were significantly reduced, compared to control flies. Moderate levels of downregulation of the dSAMTOR gene did not affect the external morphology of either wings or eyes. Survival profiles affected in a tissue- and sex-dependent manner, while climbing capacity was reduced only upon moderate dSAMTOR silencing in motoneurons. Methionine and betaine treatment of dSAMTOR mildly targeted flies, specifically in neuronal tissues, resulted in reduced viability.For the first time, to the best of our knowledge, we herein prove the: •Successful modeling of human Tuberous Sclerosis in an invertebrate model organism, the Drosophila •Critical contribution, with an autonomous and self-powered manner, of fly’s multiple organic systems, to the acquired pathology of TSC gene-specific and age-dependent compromise in lifespan and neuromuscular integrity •Differential involvement of dTSC1 and dTSC2 genes in the Tuberous Sclerosis pathology observed in TSC-targeted fly environments •Capacity of dTSC1 and dTSC2 proteins to signal in an opposite fashion and pattern compared to the TBC1D7 component, regarding their functionality against dTOR kinase activities, both in systemic and tissue-specific settings •Mechanistic value of multiple transcriptomic, proteomic, metabolomic and kinomic biomarkers, for the identification of TSC-modelled pathology, with emphasis in those controlling immune responses and carbohydrate metabolism pathways •Major role of (mid-)gut microbiome re-programming, as a critical response to (d)TORC1-complex dysregulation, and the development of modelled Tuberous Sclerosis pathology, in TSC-targeted in vivo environments, during Drosophila aging •Ability of the in vivo development of novel and powerful chemotherapeutic schemes, derived from the modelled disease, with the prospect and promise of their safe and successful administration in the clinical practice, for the Tuberous Sclerosis-suffering patients.

Οι μηχανισμοί που ελέγχουν την «οργανισμική» αύξηση, και το συντονισμό αυτής, με τη διαθεσιμότητα θρεπτικών στοιχείων στα κυτταρικά μικρο-περιβάλλοντα παρέμεναν άγνωστοι μέχρι πριν λίγες δεκαετίες. Είναι πλέον ευρέως αποδεκτό, ότι ο «μηχανιστικός στόχος της ραπαμυκίνης», mTOR, λειτουργεί ως κύριος αισθητήρας «τροφής» και ρυθμιστής της ζωικής ανάπτυξης, ενώ παίζει κεντρικό ρόλο στη φυσιολογία, το μεταβολισμό, τη γήρανση και τις ασθένειες. Η απορρύθμισή του έχει συσχετιστεί έντονα με μία σειρά ανθρώπινων διαταραχών, όπως ο διαβήτης, οι νευροεκφυλιστικές ασθένειες και ο καρκίνος. Η mTOR είναι μία πρωτεϊνική κινάση σερίνης/θρεονίνης, η οποία αποτελεί την καταλυτική υπομονάδα δύο διακριτών πολυ-πρωτεϊνικών συμπλόκων, αποκαλούμενα mTORC1 και mTORC2. Η λειτουργία τους, η εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα, τα ανωρροϊκά ερεθίσματα, η σηματοδότηση κατωρροϊκά αυτών και η ευαισθησία τους στη ραπαμυκίνη διαφέρουν σημαντικά, καθώς τα σύμπλοκα αυτά απαρτίζονται από διαφορετικές πρωτεϊνικές υπομονάδες. Από τα δύο αυτά σύμπλοκα, το mTORC1 είναι το καλύτερα χαρακτηρισμένο. Ελέγχει την κυτταρική ανάπτυξη και τον μεταβολισμό, ρυθμίζοντας αναβολικές και καταβολικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της σύνθεσης των πρωτεϊνών, των λιπιδίων και των νουκλεοτιδίων, καθώς επίσης αναστέλλει την αυτοφαγία, ως απόκριση σε κρίσιμα περιβαλλοντικά ερεθίσματα, όπως οι αυξητικοί παράγοντες, η ενεργειακή κατάσταση, το οξυγόνο, το στρες και κυρίως τα αμινοξέα. Ένας από τους καθοριστικούς ρυθμιστές του mTORC1 είναι το ετεροτριμερές πρωτεϊνικό σύμπλοκο TSC (Tuberous Sclerosis Complex). Οι πρωτεΐνες TSC1 και TSC2 συνδέονται με την πρωτεΐνη TBC1D7 και σχηματίζουν το λειτουργικό σύμπλοκο TSC, το οποίον είναι και βασικός καταστολέας του συμπλέγματος mTORC1. Μεταλλαγές στα γονίδια TSC1 ή/και TSC2 που κωδικοποιούν τις εν λόγω πρωτεΐνες ευθύνονται για την εμφάνιση της Οζώδους Σκλήρυνσης στον άνθρωπο. Η Οζώδης Σκλήρυνση αποτελεί μία αυτοσωμική, επικρατή, γενετική διαταραχή, με κύριο γνώρισμα την ύπαρξη καλοηθών όγκων (αμαρτώματα) σε πολλαπλά οργανικά συστήματα. Είναι εντυπωσιακό, ότι μεταλλαγές στα TSC1 ή/και TSC2 γονίδια ευθύνονται για το ~85% των ασθενών, ενώ το ~15% αυτών με διαγνωσμένη Οζώδη Σκλήρυνση δεν φέρει εμφανή μεταλλαγή σε κανένα εκ των δύο γονιδίων.Στόχος της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής είναι η ανάπτυξη μίας καινοτόμου βιολογικής πλατφόρμας που θα αναπαράγει αξιόπιστα και αποτελεσματικά, και θα «μοντελοποιεί», την Οζώδη Σκλήρυνση, χρησιμοποιώντας ως πρότυπο ζωικό μοντέλο την Drosophila melanogaster. Η D. melanogaster αντιπροσωπεύει έναν από τους πιο ισχυρούς πρότυπους οργανισμούς-μοντέλα και χρησιμοποιείται παγκοσμίως από πολυάριθμα εργαστήρια στη βιολογική έρευνα για την αποσαφήνιση σημαντικών ερωτημάτων που αφορούν στους μοριακούς μηχανισμούς της ανάπτυξης, της διαφοροποίησης και της γήρανσης, λόγω των πλεονεκτημάτων που φέρει ως πειραματικό σύστημα-μοντέλο. Με την χρήση προηγμένων βιοπληροφορικών εργαλείων και βάσεων δεδομένων που προσφέρονται ελεύθερα, όπως η "FlyBase" (flybase.org), το "Ensembl Genome Browser 91" (ensembl.org) και το "BLAST-NCBI-NIH" (ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), εντοπίσαμε in silico τα ομόλογα TSC1, TSC2 και TBC1D7 γονίδια στην Drosophila (dTSC1, dTSC2 και dTBC1D7), και πραγματοποιήσαμε αποσιώπηση της (μετα-)μεταγραφικής/μεταφραστικής τους έκφρασης, μέσω της χρήσης του γενετικού εργαλείου GAL4/UAS και της RNAi τεχνολογίας, σε πληθώρα διαφορετικούς ιστούς. Οι αποκτηθέντες φαινότυποι -φυσικού και γενετικά στοχευμένου τύπου- απομονωμένων οργάνων αξιολογήθηκαν μέσω φωτονικής (στερεο-)μικροσκοπίας και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης (SEM). Η νευρολογική/νευρωνική/νευρομυική επάρκεια του οργανισμού εκτιμήθηκε μελετώντας το προφίλ επιβίωσης και τα μοτίβα του αρνητικού γεωτακτισμού, τόσο σε έντομα διασταύρωσης ελέγχου όσο και σε γενετικά στοχευμένα έντομα, κατά τη διάρκεια της γήρανσης. Σε έντομα με μειορρυθμισμένα τα γονίδια dTSC1 και dTSC2 στο νευρικό σύστημα, λόγω της ισχυρής παθολογίας που παρουσίασαν, πραγματοποιήθηκε μικρο-ανατομία εγκεφάλου και απομόνωση πρωτεϊνών, οι οποίες, εν συνεχεία, μελετήθηκαν μέσω στυπώματος Western για τυχόν ενεργοποίηση, μέσω φωσφορυλίωσης, κρίσιμων dTOR κατωρροϊκών τελεστών, όπως οι πρωτεΐνη dS6K(1). Επιπλέον, υγιή έντομα (αναφοράς/μάρτυρες) και διαγονιδιακά έντομα με αποσιώπηση των γονίδιων dTSC1 ή dTSC2 (εκλεκτικά) στο νευρικό σύστημα, χαρτογραφήθηκαν ενδελεχώς ως προς το περιεχόμενο των πρωτεωμάτων (μέσω της προηγμένης τεχνολογίας nano-LC-MS/MS), των μεταγραφωμάτων (μέσω της τεχνολογίας αιχμής RNA-Seq.), και των μεταβολωμάτων (μέσω της νέας γενεάς τεχνολογίας LC-MS/MS) τους, καθώς, επίσης, υπεβλήθησαν σε πλήρη χαρτογράφηση του ενεργού τους κινώματος, μέσω της σύγχρονης τεχνολογίας PamGene. Τα βακτήρια του εντέρου συνδέονται με διάφορες λειτουργίες και συγκεκριμένες ασθένειες, και το εντερικό μικροβίωμα φαίνεται να επηρεάζει καθοριστικά τη φυσιολογία και το μεταβολισμό του ξενιστή. Ως εκ τούτου, απομονώθηκε βακτηριακό DNA από τον ιστό του εντέρου εντόμων με μειορρύθμιση των γονιδίων dTSC1 ή dTSC2 (ειδικά) στο (μέσο) έντερο, και πραγματοποιήθηκε ενδελεχής και συστημική ανάλυση του μικροβιώματος, σε σχέση με τις συνθήκες αναφοράς (υγιή έντομα). Τέλος, σε έντομα με την ισχυρότερη, ανιχνεύσιμη, παθολογία χορηγήθηκαν είτε αναστολείς της ενεργότητας της mTOR κινάσης, είτε επαγωγείς της αυτοφαγίας (καταστέλλεται από την σηματοδοτική δράση του mTORC1 συμπλόκου), με σκοπό την αναστροφή της εγκεφαλικής παθολογίας, και την ανάπτυξη μίας νέας χημειοθεραπευτικής in vivo πλατφόρμας για την Οζώδη Σκλήρυνση. Η μειορρύθμιση τόσο του dTSC1 γονιδίου όσο και του dTSC2 στους οφθαλμούς του εντόμου είχε ως αποτέλεσμα την αλλοίωση της μορφολογίας του οφθαλμού από νεαρή ηλικία (10 ημερών), με προοδευτική απώλεια βλεφαρίδων, η οποία εντάθηκε κατά τη διάρκεια της γήρανσης. Από την άλλη πλευρά, η μειορρύθμιση της πρωτεΐνης dTBC1D7 στους οφθαλμούς δεν προκάλεσε κάποιον παθολογικό φαινότυπο. Η δομή και η αρχιτεκτονική οργάνωση των φτερών αλλοιώθηκε εντόνως κατόπιν γονιδιακής αποσιώπησης τόσο του dTSC1 γονιδίου όσο και του γονιδίου dTSC2, με τους παρατηρηθέντες φαινοτύπους να ποικίλουν. Η μειορρύθμιση της πρωτεΐνης dTBC1D7 δεν επηρέασε τη μορφολογία των φτερών, ωστόσο παρατηρήθηκε σε αρσενικά έντομα μια τάση αύξησης του μεγέθους των φτερών, συγκριτικά με τα έντομα διασταύρωσης ελέγχου. Το προφίλ επιβίωσης των θηλυκών αλλά και των αρσενικών εντόμων με αποσιώπηση του dTSC1 γονιδίου παρουσιάστηκε δραματικά μειωμένο συγκριτικά με τις συνθήκες control σε όλα τα οργανικά συστήματα που μελετήθηκαν (νευρικό σύστημα, σύστημα γιγαντιαίου νευρώνα, χολινεργικοί/ντοπαμινεργικοί/γλουταμινεργικοί/σεροτονεργικοί/γ-αμινο-βουτυρικοί νευρώνες, ενδιάμεσος νευρώνας, κινητικοί νευρώνες, μυς, έντερο) εκτός από τα κύτταρα της γλοίας όπου δεν υπήρξε κάποια αξιοσημείωτη μεταβολή. Η μειορρύθμιση του dTSC1 γονιδίου επηρέασε και την αναρριχητική ικανότητα των εντόμων η οποία εμφανίζεται μειωμένη, και στα δύο φύλα, (εξαιρούνται οι ντοπαμινεργικοί και γ-αμινο-βουτυρικοί νευρώνες), με τον ισχυρότερο και παθολογικότερο φαινότυπο να παρατηρείται ύστερα από μειορρύθμιση του γονιδίου στο νευρικό σύστημα και στον ενδιάμεσο νευρώνα, γεγονός που επιβεβαιώθηκε και μέσω ηλεκτροφυσιολογίας. Η χορήγηση του αναστολέα της dTOR κινάσης, Ridaforolimus, σε έντομα με μειορρύθμιση του dTSC1 γονιδίου στο νευρικό σύστημα λόγω της ισχυρής παθολογίας που εμφάνισαν, προκάλεσε τη σημαντική αύξηση του προσδόκιμου ζωής των θηλυκών εντόμων.Η μειορρύθμιση του dTSC2 γονιδίου επηρέασε τη βιωσιμότητα και την αναρριχητική ικαντότητα των εντόμων με φυλο- και ιστο- εξαρτώμενο τρόπο. Η επιβίωση των θηλυκών εντόμων εμφανίστηκε στατιστικά σημαντικά μειωμένη ύστερα αποσιώπηση του γονιδίου στο νευρικό σύστημα, στο σύστημα του γιγαντιαίου νευρώνα, στους χολινεργικούς /ντοπαμινεργικούς/γλουταμινεργικούς και γ-αμινο-βουτυρικούς νευρώνες, στον ενδιάμεσο νευρώνα, τους κινητικούς νευρώνες, και στο έντερο. Στα αρσενικά έντομα η βιωσιμότητα διαταράχτηκε, συγκριτικά με τις συνθήκες control, μετά από γονιδιακή αποσιώπηση του dTSC2, στους χολινεργικούς /ντοπαμινεργικούς/γλουταμινεργικούς, γ-αμινο-βουτυρικούς νευρώνες καθώς επίσης και στα κύτταρα της γλοίας. Τα θηλυκά παρουσίασαν κινητική δυσλειτουργία ύστερα από μειορρύθμιση του γονιδίου στο νευρικό σύστημα, στο σύστημα του γιγαντιαίου νευρώνα, στους γλουταμινεργικούς και κινητικούς νευρώνες καθώς επίσης και στα κύτταρα της γλοίας. Στα αρσενικά άτομα, η ικανότητα αναρρίχησης εμφανίστηκε μειωμένη στην πλειοψηφία των μελετηθέντων ιστών. Η χορήγηση των αναστολέων της dTOR κινάσης, Ridaforolimus και Εverolimus, καθώς επίσης και του επαγωγέα της αυτοφαγίας Σπερμιδίνη, σε έντομα με μειορρύθμιση του dTSC2 γονιδίου στο νευρικό σύστημα λόγω της ισχυρής κινητικής δυσχέρειας που εμφάνισαν, προκάλεσε τη σημαντική αύξηση της αναρριχητικής ικανότητας των αρσενικών εντόμων. Η χαρτογράφηση του μεταβολώματος, του πρωτεώματος και του ενεργού κινώματος σε έντομα με μειορρύθμιση των γονιδίων dTSC1 και dTSC2 στο νευρικό σύστημα αποκάλυψε μια σειρά νέων βιο-δεικτών. Από τη μελέτη της δράσης των ενεργών κινασών σε εγκεφάλους εντόμων με μειορρύθμιση των γονιδίων dTSC1 ή dTSC2 προέκυψε σημαντική αύξηση της ενεργότητας διαφόρων κινασών, συμπεριλαμβανομένων υποστρωμάτων του dTORC1 συμπλόκου, όπως είναι η dp70S6K. Ως προς τη μεταβολωμική ανάλυση, η αποσιώπηση του γονιδίου dTSC1, που οδηγεί σε απορρύθμιση του dTOR σηματοδοτικού δικτύου, είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση του μεταβολίτη της βεταίνης, ενός σακχάρου που συμμετέχει στο μεταβολισμό της μεθεϊονίνης, ενώ η αποσιώπηση του γονιδίου dTSC2 οδήγησε σε αύξηση του δισακχαρίτη τριαλόζη. H χαρτογράφηση του μεταγραφώματος εντόμων με μειορρύθμιση του dTSC1 γονιδίου ανέδειξε την ενεργοποίηση της μεταγραφής πληθώρας γονιδίων που σχετίζονται με τη δράση του ανοσοποιητικού συστήματος της D. melanogaster. Τέλος, από την ανάλυση του μικροβιώματος τόσο σε έντομα με αποσιώπηση του dTSC1 γονιδίου, όσο και με αποσιώπηση του dTSC2 γονιδίου στον ιστό σου εντέρου, παρατηρήθηκαν μεγάλες διαφοροποιήσεις στο μικροβιακό φορτίο μεταξύ διαγονιδιακών εντόμων και εντόμων διασταύρωσης ελέγχου.Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την αποσιώπηση του γονιδίου dTBC1D7 δείχνουν πως η απουσία της πρωτεΐνης έχει αντίστροφη επίδραση από την απώλεια των πρωτεϊνών dTSC1 και dTSC2. Αναλυτικότερα, η επιβίωση των θηλυκών διαγονιδιακών εντόμων ήταν σημαντικά αυξημένη συγκριτικά με τα υγιή έντομα, στο νευρικό σύστημα, στους γλουταμινεργικούς και κινητικούς νευρώνες, στους μυς και στο έντερο, ενώ στα αρσενικά υπήρξε αυξημένο προσδόκιμο ζωής σε όλους τους μελετηθέντες ιστούς, εκτός του νευρικού συστήματος. Η ικανότητα αναρρίχησης των θηλυκών εντόμων με μειορρύθμιση του γονιδίου dTBC1D7 δεν εμφάνισε αξιοσημείωτες μεταβολές συγκριτικά με τα έντομα control, ενώ στα αρσενικά διαπιστώθηκε μια τάση μείωσης της κινητικής δραστηριότητας στους χολινεργικούς, σεροτονεργικούς και κινητικούς νευρώνες, στα κύτταρα της γλοίας, στους μυς και στο έντερο.Τέλος, μελετήθηκε ο ρόλος της πρωτεΐνης SAMTOR, μιας πρωτεΐνης που σηματοδοτεί έμμεσα τα επίπεδα της μεθειονίνης στο mTORC1 σύμπλοκο. Υψηλά επίπεδα μειορρύθμισης της dSAMTOR πρωτεΐνης σε μια πληθώρα ιστών (ολόκληρο το σώμα, νευρικό σύστημα, κινητικοί νευρώνες, μυς, κύτταρα γλοίας) οδήγησε σε μη βιώσιμα έντομα, ενώ η μειορρύθμιση στους οφθαλμούς και στα φτερά προκάλεσε έντονη απώλεια βλεφαρίδων και δυσμορφικά φτερά, αντίστοιχα. Η επιβίωση των εντόμων και των δύο φύλων, ύστερα από υψηλά ποσοστά μειορρύθμισης του γονιδίου στον ιστό που εντέρου, παρατηρήθηκε σημαντικά μειωμένη, συγκριτικά με τα υγιή έντομα. Μέτρια επίπεδα μειορρύθμισης του γονιδίου dSAMTOR δεν επηρέασαν την εξωτερική μορφολογία ούτε των φτερών ούτε των οφθαλμών. Το προφίλ επιβίωσης επηρεάστηκε ιστο- και φυλο-ειδικά ενώ η αναρριχητική ικανότητα εμφανίστηκε μειωμένη μόνο κατόπιν αποσιώπησης του γονιδίου στους κινητικούς νευρώνες. Η εξωγενής χορήγηση της μεθειονίνης, σε έντομα με μειορρύθμιση του dSAMTOR γονιδίου, μείωσε το προσδόκιμο ζωής των εντόμων και των δύο φύλων, ενώ η χορήγηση της βεταινης βελτίωσε την βιωσιμότητα των αρσενικών εντόμων.Για πρώτη φορά αποδεικνύεται: •Η επιτυχής «μοντελοποίηση» της ανθρώπινης Οζώδου Σκλήρυνσης σε έναν πρότυπο ασπόνδυλο οργανισμό, την Drosophila•Η κρίσιμη συμμετοχή, με αυτόνομο και αυτοδύναμο τρόπο, πολλών και διαφορετικών οργανικών συστημάτων του εντόμου στην αποκτώμενη παθολογία της TSC-γονιδιο-ειδικής και ηλικιο-εξαρτώμενης έκπτωσης τόσο στο προσδόκιμο ζωής, όσο και στη νευρομυϊκή λειτουργία και ακεραιότητα •Η διαφορική συμβολή των dTSC1 και dTSC2 γονιδίων στην παρατηρούμενη παθολογία της Οζώδου Σκλήρυνσης σε περιβάλλοντα διαγονιδιακών εντόμων •Η ικανότητα των dTSC1 και dTSC2 πρωτεϊνών να σηματοδοτούν αντίθετα από το dTBC1D7 συστατικό, ως προς την λειτουργική τους επίδραση, επί της dTOR κινάσης, τόσο σε συστημικό όσο και σε ιστο-ειδικό επίπεδο •Η μηχανιστική αξία πλήθους μεταγραφωμικών, πρωτεωμικών, μεταβολωμικών και κινωμικών βιο-δεικτών, ταυτοποίησης της «μοντελοποιημένης» παθολογίας, με έμφαση σε αυτούς που σχετίζονται με ανοσολογικές αποκρίσεις, αλλά και μεταβολισμό υδατανθράκων •Ο σημαντικός ρόλος του (μεσο-)εντερικού μικροβιώματος, ως απόκριση στην δυσλειτουργία του dTORC1 συμπλόκου, και την εμφάνιση «μοντελοποιημένης» Οζώδου Σκλήρυνσης, σε in vivo συνθήκες διαγονιδιακών εντόμων, υπό φάση γήρανσης •Η δυνατότητα in vivo ανάπτυξης νέων χημειοθεραπευτικών σχημάτων, βασισμένων στην «μοντελοποιημένη» νόσο, με προοπτική και δυνατότητα επιτυχούς και ασφαλούς εφαρμογής τους, στην κλινική πράξη, για τους πάσχοντες από Οζώδη Σκλήρυνση ασθενείς.