Μελέτη του ρόλου της σουμοϋλίωσης στη ρύθμιση και λειτουργία της πρωτεΐνης EXOSC10 κατά την υποξία

Abstract

SUMOylation is a dynamic post-translational modification referring to the covalent attachment of SUMO proteins (Small Ubiquitin-like Modifier) to target proteins. Recent studies have shown that SUMOylation plays an important role in cellular adaptation and survival under stress conditions such as low oxygen concentration (hypoxia). Specifically, SUMOylation affects the master regulators of the hypoxic response pathway, the transcription factors HIFs (Hypoxia Inducible Factors) directly (via covalent modification) or indirectly, by affecting the function of proteins associated with the hypoxic cascade. Immunoprecipitation and mass spectrometry experiments showed that hypoxia (1% Ο2) causes the de-SUMOylation of the protein EXOSC10. EXOSC10 is a catalytic subunit of the multiprotein RNA exosome complex, with roles in processing and degradation of various RNAs. This doctoral thesis focused on the study of EXOSC10 SUMOylation in two separate axons: the elucidation of the influence of hypoxia on EXOSC10 SUMOylation mechanism and, the investigation of the biological role of SUMOylation in the cellular function of EXOSC10 and its significance for the cellular response to hypoxia. Specifically, it was shown that EXOSC10 SUMOylation is significantly reduced within the first hours of incubation in hypoxia through a mechanism that does not directly involve the HIFs. Interestingly, during the same timeframe, there was a statistically significant relocation of EXOSC10 from the nucleolus to the nucleoplasm, indicating that the two processes are related. Silencing experiments of known enzymes of the SUMOylation machinery revealed that USP36 is necessary for the SUMOylation of EXOSC10, while SENP3 promotes the deconjugation of SUMO from it. These three proteins are found in a common complex in the nucleolus. It was shown that hypoxia leads to the relocation of EXOSC10 to the nucleoplasm and the subsequent inhibition of its interaction with USP36, explaining the observed de-SUMOylation of EXOSC10 during hypoxia. On the second axon regarding the biological role of SUMOylation in the cellular function of EXOSC10 in the context of the cellular response to hypoxia, experiments of total RNA sequencing of HeLa cells grown in normoxic and hypoxic conditions or in cell lines expressing the SUMO-deficient form of EXOSC10 over the wild type EXOSC10, showed the differential regulation of the expression levels of a group of RNAs, that are also hypoxia targets. Overall, this doctoral thesis reveals the dynamic regulation of the SUMOylation and the intracellular localization of the exoribonuclease EXOSC10 induced by hypoxia, which in turn regulate the RNA degradation mechanism, facilitating the adaptation of cells to the present oxygen levels.

Η σουμοϋλίωση είναι μια δυναμική μετα-μεταφραστική τροποποίηση κατά την οποία πραγματοποιείται ομοιοπολική σύζευξη των πρωτεϊνών SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) στις πρωτεΐνες-στόχους. Μελέτες των τελευταίων ετών δείχνουν πως η σουμοϋλίωση παίζει σημαντικό ρόλο στην προσαρμογή και επιβίωση των κυττάρων σε συνθήκες στρες όπως η χαμηλή συγκέντρωση οξυγόνου (υποξία). Ειδικότερα, η σουμοϋλίωση επηρεάζει τους κύριους μεταγραφικούς παράγοντες και ρυθμιστές του μονοπατιού της υποξίας HIFs (Hypoxia Inducible Factors) άμεσα (μέσω ομοιοπολικής τροποποίησης) ή έμμεσα επηρεάζοντας τη δράση πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη ρύθμιση τους. Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης και φασματοσκοπίας μάζας έδειξαν πως η υποξία (1% Ο2) προκαλεί την αποσουμοϋλίωση της πρωτεΐνης EXOSC10. H ΕXOSC10 είναι μια καταλυτική υπομονάδα του πολύ-πρωτεϊνικού συμπλόκου του RNA εξωσώματος, με δράση στην επεξεργασία και την αποικοδόμηση διαφόρων RNA. Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάστηκε στη μελέτη της σουμοϋλίωσης της EXOSC10 όσον αφορά πρώτον στην πλήρη αποσαφήνιση της επίδρασης της υποξίας στον μηχανισμό σουμοϋλίωσης της και δεύτερον στη διερεύνηση του βιολογικού ρόλου της σουμοϋλίωσης στην λειτουργία της EXOSC10 και της σημασίας της για την κυτταρική απόκριση στην υποξία. Συγκεκριμένα, δείχθηκε πως η σουμοϋλίωση της EXOSC10 μειώνεται αισθητά από τις πρώτες κιόλας ώρες επώασης στην υποξία με έναν μηχανισμό στον οποίο δεν εμπλέκονται άμεσα οι HIF. Ενδιαφέρον παρουσίασε το γεγονός πως στο ίδιο χρονικό πλαίσιο παρατηρήθηκε μετακίνηση της EXOSC10 από τον πυρηνίσκο προς το πυρηνόπλασμα, υποδεικνύοντας πως οι δυο διαδικασίες σχετίζονται. Πειράματα αποσιώπησης γνωστών ενζύμων του μηχανισμού σουμοϋλίωσης αποκάλυψαν πως η USP36 είναι απαραίτητη για την σουμοϋλίωση της EXOSC10, ενώ η SENP3 συμμετέχει στην απομάκρυνση της SUMO από αυτή. Οι τρεις αυτές πρωτεΐνες βρίσκονται σε κοινό σύμπλοκο στον πυρηνίσκο. Βρέθηκε πως η υποξία οδηγεί στην μετακίνηση της EXOSC10 στο πυρηνόπλασμα και την επακόλουθη κατάργηση της αλληλεπίδρασης της με την USP36, γεγονός που εξηγεί την παρατηρούμενη αποσουμοϋλίωση. Όσον αφορά στο δεύτερο ερευνητικό ερώτημα σχετικά με την διερεύνηση του βιολογικού ρόλου της σουμοϋλίωσης στην λειτουργία της EXOSC10 στο πλαίσιο της κυτταρικής απόκρισης στην υποξία, με πειράματα αλληλούχησης του ολικού RNA καρκινικών κυττάρων HeLa σε συνθήκες νορμοξίας και υποξίας ή σε κυτταρικές σειρές που εκφράζουν την αγρίου τύπου EXOSC10 ή την μη σουμοϋλιωμένη μορφή της (Κ583R), έδειξαν την διαφορική ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης μιας ομάδας RNA που αποτελούν και στόχους της υποξίας. Συνολικά, η παρούσα διδακτορική διατριβή αποκαλύπτει την δυναμική ρύθμιση της σουμοϋλίωσης και του ενδοκυτταρικού εντοπισμού της εξωριβονουκλεάσης EXOSC10 από την υποξία, διεργασίες που οδηγούν στη ρύθμιση του μηχανισμού αποικοδόμησης mRNA στόχων της υποξίας, διευκολύνοντας την προσαρμογή των κυττάρων στις νέες συνθήκες οξυγόνου.