Γενετικοί και επιγενετικοί παράγοντες στην οστεοαρθρίτιδα: ο ρόλος των microRNAs

Abstract

Osteoarthritis (OA) is the most common chronic degenerative joint disease, causing significant pain and disability. It affects all joints in the body with the knee joint bearing the greatest burden. OA affects structural elements of the joint, characterized by degeneration of joint cartilage, formation of osteophytes, subchondral bone sclerosis, and synovial membrane hypertrophy. Globally, it is estimated that around 500 million people suffer from OA. Various risk factors such as aging, obesity, gender, joint injury, and heredity have been associated with the development and progression of OA. However, the precise molecular mechanisms underlying OA pathogenesis remain unclear. Despite the significant burden of OA on patients and healthcare systems, there are currently no sensitive biomarkers for early detection of the disease, nor effective therapeutic options apart from joint replacement surgery (knee or hip) in advanced stages of the disease. The standard method for diagnosing and assessing the severity of knee OA is through radiography based on the Kellgren/Lawrence grading scale. Therefore, there is a need to identify non-invasive and sensitive biomarkers for the early prediction and diagnosis of OA, for the early treatment and the optimization of the clinical management of the disease. Recent studies have reported that small non-coding RNAs called microRNAs (miRNAs) are considered as promising biomarkers for various diseases such as cancer, diabetes, cardiovascular diseases, and OA. MiRNAs are a group of small non-coding RNA molecules, approximately 22-28 nucleotides in length, that regulate gene expression post-transcriptionally by degrading or inhibiting the translation of target mRNAs. Each miRNA can target multiple genes by binding primarily to the 3' untranslated region (UTR) of their target mRNAs. MiRNAs are involved in processes related to OA pathogenesis, such as cartilage homeostasis, regulation of the extracellular matrix, osteogenesis, bone metabolism, apoptosis, inflammation, and lipid metabolism. Additionally, miRNAs have been found in circulation, suggesting their potential as biomarkers. They can be transported through microvesicles, exosomes, protein complexes like Ago, or high-density lipoproteins (HDL), reflecting the cellular content or mediating intercellular signaling, providing valuable information about the pathophysiological state of cells. MiRNAs are attractive as biomarkers due to their stability, tissue-specific expression, non-invasive detection, and regulation of gene expression. Furthermore, advances in molecular biology techniques have facilitated sensitive and accurate detection of miRNAs. Microarray technology is a valuable tool for investigating miRNA expression profiles and their role in the pathogenesis of various diseases. Moreover, miRNAs represent potential therapeutic targets for developing personalized therapeutic strategies for the disease. Specifically, hsa-miR-140, extensively studied in OA, plays a significant role in chondrocyte homeostasis and chondrogenesis. It has been reported to show differential expression in OA cartilage and synovial fluid but not in serum. Hsa-miR-140 generates two mature microRNAs: hsa-miR-140-5p and hsa-miR-140-3p.The aim of the present thesis is the investigation of miRNAs involved in significant processes related to OA pathogenesis, in the serum of individuals with knee osteoarthritis (OA) and the identification of implicated mechanisms controlling their actions. The goal was to highlight miRNAs that could emerge as potentially important prognostic/diagnostic biomarkers for OA. Cartilage samples from patients with primary osteoarthritis who had undergone total knee arthroplasty were used. Patients with rheumatoid arthritis or arthritis and other autoimmune diseases, as well as chondrodysplasia, septic OA and post-traumatic OA were excluded from the study. For the control group, cartilage samples were obtained from individuals, with no history of joint disease, who had undergone severe fracture repair surgery or amputation. More precisely, a comprehensive analysis of miRNA expression profiles was conducted using high-density miRNA arrays in the serum of OA patients compared to healthy individuals. The Agilent Human miRNA Microarray platform, interrogating 2,549 miRNAs, was used. ROC curves were constructed to evaluate the diagnostic value of the differentially expressed miRNAs in the serum of OA patients and healthy individuals. The expression levels of specific miRNAs, which showed the greatest differences in the serum between OA and the control group, such as hsa-miR-33b-3p, hsa-miR-4284, hsa-miR-663a, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-1233-3p, hsa-miR-140-3p, and hsa-miR-671-3p, were validated in samples of articular cartilage from the same individuals. Bioinformatics tools were used to investigate the predicted molecular signaling pathways and the target genes of the differentially expressed miRNAs. Subsequently, hsa-miR-140-3p was selected to further investigate its role in OA. Protein-protein interaction networks of the target genes of hsa-miR-140-3p were constructed using bioinformatics tools. Transfection of OA chondrocytes with miR-140-3p mimic was performed, and its impact on the transcriptional levels of potential target genes such as PTEN, TGFa, BCL-2, SIRT-1, HMGCR and HDAC4, as well as molecular markers related to cartilage homeostasis, specifically MMP-13, TNFA, and COL2A1, was investigated. The results of the thesis revealed 279 miRNAs deregulated in the serum of OA patients compared to the control group, 205 miRNAs (73.5%) showed increased expression and 74 miRNAs (26.5%) exhibited decreased expression. ROC analysis identified 77 miRNAs with AUC>0.8 and p-values<0.05, indicating their diagnostic potential. Bioinformatics analysis of these 77 miRNAs revealed their involvement in multiple signaling pathways related to OA, such as FoxO, mTOR, Wnt, PI3K/Akt, adipocytokine, TGF-β, ECM receptor, and fatty acid biosynthesis pathways. The expression levels of the selected miRNAs (hsa-miR-33b-3p, hsa-miR-4284, hsa-miR-663a, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-1233-3p, hsa-miR-140-3p, and hsa-miR-671-3p) were validated with qRT-PCR, showing reduced expression of three miRNAs (hsa-miR-33b-3p, hsa-miR-671-3p, and hsa-miR-140-3p) in the serum of OA patients compared to healthy individuals. Hsa-miR-140-3p and hsa-miR-671-3p expression levels were consistently downregulated in articular cartilage of OA patients compared to healthy individuals, confirming their presence in the OA joint environment. Through bioinformatics analysis, the target genes of hsa-miR-140-3p associated with osteoarthritis were identified. Notably, significant protein-protein interaction networks involving these target genes were discovered through network topology analysis and pathway-gene ontology analysis. Considering these bioinformatics findings, PTEN emerged as a gene displaying high connectivity in the PPI network and involvement in multiple pathways/processes crucial for OA. Furthermore, the analysis of the 3' UTR mRNA of PTEN to identify functional binding sites of hsa-miR-140-3p, using the bioinformatics tool TargetScanHuman 8.0, revealed the presence of specific sequences recognized by hsa-miR-140-3p. Specifically, two complementary sequences for miR-140-3p were found in the 3' UTR of PTEN, at positions 1763-1769 and 2882-2888. Treatment of OA chondrocytes with miR-140-3p mimic (100 nM) for 72 hours resulted in significant reduction of PTEN mRNA expression levels compared to untreated cells. These findings combined with the results showing increased PTEN transcriptional levels and decreased hsa-miR-140-3p levels in osteoarthritic chondrocytes compared to normal, indicate an inverse correlation between these two molecules, highlighting the role of miR-140-3p in PTEN regulation, and a potential molecular mechanism contributing to the differential expression of PTEN in OA cartilage. Moreover, treatment of OA chondrocytes with miR-140-3p mimic resulted in significantly decreased HMGCR, HDAC4, and MMP-13 mRNA expression levels and increased BCL-2 mRNA expression levels compared to untreated cells. In conclusion, a signature of three miRNAs (hsa-miR-140-3p, hsa-miR-671-3p, and hsa-miR-33b-3p) was identified in the serum of OA patients using miRNA microarrays. These miRNAs could be considered as potential biomarkers for assessing the risk and progression of OA. Additionally, hsa-miR-140-3p was identified not only as a biomarker but also as a potential therapeutic target for osteoarthritis. The use of miR inhibitors or mimics has been shown to have therapeutic benefits in preclinical (animal) models of the disease, indicating that it is a promising approach for slowing down the progression of OA at early stages.

Η Οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) αποτελεί τη πιο κοινή χρόνια εκφυλιστική νόσο των αρθρώσεων και είναι κύρια αιτία πόνου και αναπηρίας. Είναι μία νόσος που πλήττει όλες τις αρθρώσεις του σώματος με μεγαλύτερη επιβάρυνση στην άρθρωση του γονάτου, ενώ επηρεάζει και τα δομικά στοιχεία της άρθρωσης, με κύρια χαρακτηριστικά της τον εκφυλισμό του αρθρικού χόνδρου, το σχηματισμό οστεοφύτων, τη σκλήρυνση του υποχόνδριου οστού και την υπερτροφία του αρθρικού υμένα. Σε παγκόσμιο επίπεδο, εκτιμάται ότι περίπου 500 εκατομμύρια άτομα πάσχουν από ΟΑ. Διάφοροι παράγοντες κινδύνου, όπως η γήρανση, η παχυσαρκία, το φύλο, ο τραυματισμός των αρθρώσεων και η κληρονομικότητα, έχουν συσχετιστεί με την ανάπτυξη και την εξέλιξη της ΟΑ. Ωστόσο, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην παθογένεια της ΟΑ παραμένουν ασαφείς. Παρά τη σημαντική επιβάρυνση της ΟΑ για τους ασθενείς και τα συστήματα υγειονομικής περίθαλψης, έως σήμερα δεν υπάρχουν ευαίσθητοι βιοδείκτες για την ανίχνευση της νόσου σε πρώιμα στάδια, ούτε αποτελεσματικές θεραπευτικές επιλογές εκτός της αρθροπλαστικής χειρουργικής επέμβασης (γόνατος ή ισχίου) σε προχωρημένα στάδια της νόσου. Η τυπική μέθοδος για τη διάγνωση και την αξιολόγηση της βαρύτητας της ΟΑ γόνατος γίνεται με ακτινογραφική απεικόνιση με βάση τη κλίμακα κατάταξης κατά Kellgren/Lawrence. Ως εκ τούτου, υπάρχει ανάγκη να εντοπιστούν μη επεμβατικοί και ευαίσθητοι βιοδείκτες για την έγκαιρη πρόγνωση και διάγνωση της ΟΑ, προκειμένου να αντιμετωπιστεί έγκαιρα και να βελτιστοποιηθεί η κλινική αντιμετώπιση της νόσου. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι τα μικρά μη κωδικά μόρια RNA (miRNAs) αποτελούν πολλά υποσχόμενους βιοδείκτες για διάφορες ασθένειες, όπως καρκίνος, διαβήτης, καρδιαγγειακές παθήσεις κ.α. Τα miRNAs είναι μια oμάδα μικρών μη κωδικών μορίων RNA, μήκους περίπου 22-28 νουκλεοτιδίων, που ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο μέσω της αποικοδόμησης ή αναστολής της μετάφρασης των mRNA στόχων. Κάθε miRNA μπορεί να ρυθμίσει μεγάλο αριθμό γονιδίων μέσω πρόσδεσης κυρίως στην 3' αμετάφραστη περιοχή (UTR) των mRNA στόχων. Τα miRNAs ενέχονται σε διαδικασίες που σχετίζονται με την παθογένεια της ΟΑ, όπως η ομοιόσταση του χόνδρου, η ρύθμιση της εξωκυττάριας μήτρας, η οστεοποίηση, ο μεταβολισμός των οστών, η απόπτωση, η αυτοφαγία, η φλεγμονή και ο μεταβολισμός των λιπιδίων. Επιπλέον, τα miRNAs έχουν βρεθεί και στη κυκλοφορία. Τα στοιχεία δείχνουν ότι τα miRNAs που κυκλοφορούν μπορούν να μεταφερθούν μέσω μικροκυστιδίων, εξωσωμάτων, συμπλεγμάτων πρωτεΐνης Ago ή λιποπρωτεΐνης υψηλής πυκνότητας (HDL) και μπορούν είτε να αντανακλούν το κυτταρικό περιεχόμενο είτε να μεσολαβούν στη διακυτταρική σηματοδότηση, παρέχοντας πληροφορίες για την παθοφυσιολογική κατάσταση του κυττάρου. Τα miRNAs θεωρούνται ελκυστικά μόρια ως βιοδείκτες λόγω της σταθερότητάς τους, της ιστοειδικής τους έκφρασης, της μη επεμβατικής ανίχνευσης και του ρυθμιστικού τους ρόλου στη γονιδιακή έκφραση. Παράλληλα, εξελίξεις στις τεχνικές της μοριακής βιολογίας έχουν διευκολύνει την ανίχνευση των miRNAs με μεγάλη ευαισθησία και ακρίβεια. Στο πλαίσιο αυτό, η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών αποτελεί ένα πολύτιμο εργαλείο για την διερεύνηση των προφίλ έκφρασης των miRNAs και τη συσχέτιση τους με την παθογένεια διαφόρων ασθενειών. Επιπλέον, τα miRNAs αποτελούν πιθανούς θεραπευτικούς στόχους για την ανάπτυξη εξατομικευμένων στρατηγικών θεραπευτικής αντιμετώπισης της νόσου. Ειδικότερα, το hsa-miR-140, το οποίο έχει μελετηθεί ευρέως στην ΟΑ, διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση και τη χονδρογένεση και έχει δειχθεί ότι εμφανίζει διαφοροποιημένη έκφρασή στον ΟΑ χόνδρο και στο αρθρικό υγρό, αλλά όχι στον ορό. To hsa-miR-140 παράγει δύο ώριμα microRNAs: το hsa-miR-140-5p και το hsa-miR-140-3p.Αντικείμενο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση του συνολικού προφίλ έκφρασης των miRNAs στον ορό ατόμων με ΟΑ γόνατος, που ενέχονται σε σημαντικές διαδικασίες με την παθογένεια της ΟΑ, και η ανεύρεση πιθανού μηχανισμού δράσης τους. Απώτερος σκοπός ήταν η ανάδειξη miRNAs που θα μπορούσαν να αποτελέσουν πιθανούς προγνωστικούς βιοδείκτες για την ΟΑ. Για τη διεξαγωγή της παρούσας μελέτης χρησιμοποιήθηκαν δείγματα ορού και αρθρικού χόνδρου ασθενών με πρωτοπαθή οστεοαρθρίτιδα που είχαν υποβληθεί σε ολική αρθροπλαστική γόνατος. Τα άτομα που εμφάνιζαν ρευματοειδή αρθρίτιδα ή αρθρίτιδα στα πλαίσια άλλου αυτοάνοσου νοσήματος, καθώς και χονδροδυσπλασία, σηπτική ΟΑ και μετα–τραυματική ΟΑ αποκλείστηκαν από τη μελέτη. Για την ομάδα ελέγχου, χρησιμοποιήθηκαν δείγματα από άτομα χωρίς ιστορικό πάθησης των αρθρώσεων, τα οποία είχαν υποβληθεί σε σοβαρή χειρουργική επέμβαση κατάγματος ή ακρωτηριασμό. Στη μελέτη πραγματοποιήθηκε ανάλυση του προφίλ έκφρασης των miRNAs χρησιμοποιώντας συστοιχίες miRNA υψηλής ευκρίνειας στον ορό ασθενών με ΟΑ και σε υγιή άτομα. Χρησιμοποιήθηκε η πλατφόρμα miRNA Microarray Agilent Human, η οποία ανιχνεύει την έκφραση 2.549 miRNAs. Οι καμπύλες ROC κατασκευάστηκαν για την αξιολόγηση της διαγνωστικής αξίας στον ορό, των miRNAs με διαφοροποιημένη έκφραση μεταξύ ΟΑ και υγιών ατόμων. Τα επίπεδα έκφρασης συγκεκριμένων miRNAs, που εμφάνιζαν τις μεγαλύτερες διαφορές στην έκφρασή τους στον ορό, μεταξύ ΟΑ και ομάδας ελέγχου, όπως hsa-miR-33b-3p, hsa-miR-4284, hsa-miR-663a, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-1233-3p, hsa-miR-140-3p, and hsa-miR-671-3p επαληθεύθηκαν και σε δείγματα αρθρικού χόνδρου ατόμων με ΟΑ. Με τη χρήση διαφόρων εργαλείων βιοπληροφορικής διερευνήθηκαν οι προβλεπόμενες μοριακές σηματοδοτήσεις και τα γονίδια στόχοι των διαφοροποιημένων miRNAs. Στην συνέχεια, επιλέχθηκε το hsa-miR-140-3p, προκειμένου να αναλυθεί περαιτέρω ο ρόλος του στην ΟΑ. Με εργαλεία βιοπληροφορικής, απεικονίστηκαν σε δίκτυα οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις των γονιδίων στόχων του hsa-miR-140-3p. Πραγματοποιήθηκαν επιδράσεις με μιμητή του miR-140-3p σε ΟΑ χονδροκύτταρα και διερευνήθηκε η επίδραση του στα μεταγραφικά επίπεδα των πιθανών γονιδίων στόχων TGFa, BCL-2, SIRT-1, HMGCR και HDAC4 και μοριακών δεικτών ομοιοστασίας του χόνδρου και συγκεκριμένα της μεταλλoπρωτεϊνάσης ΜΜΡ-13, του TNFA και του COL2A1.Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής ανέδειξαν 279 miRNAs με διαφοροποιημένη έκφραση στον ορό ασθενών με ΟΑ σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Μεταξύ αυτών, 205 miRNA (73,5%) εμφάνισαν αυξημένη έκφραση και 74 miRNAs (26,5%) εμφάνιση μειωμένη έκφραση. Η ανάλυση ROC εντόπισε 77 miRNAs με AUC>0,8 και τιμές p<0,05 υποδεικνύοντας τη διαγνωστική τους δυνατότητα. Η ανάλυση βιοπληροφορικής αυτών των 77 miRNAs ανέδειξε τη συμμετοχή τους σε πολλαπλές σηματοδοτήσεις που σχετίζονται με την ΟΑ, όπως FoxO, mTOR, Wnt, PI3K/Akt, TGF-β, ECM-υποδοχέα και βιοσύνθεσης λιπαρών οξέων. Ο προσδιορισμός της έκφρασης των επιλεγμένων miRNAs (hsa-miR-33b-3p, hsa-miR-4284, hsa-miR-663a, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-1233-3p, hsa-miR-140-3p, and hsa-miR-671-3p) με qRT-PCR επιβεβαίωσε τη μείωση της έκφρασης τριών εξ αυτών, των miRNAs hsa-miR-33b-3p, hsa-miR-671-3p και hsa-miR-140-3p στον ορό ασθενών με ΟΑ. Η μειωμένη έκφραση των hsa-miR-140-3p και hsa-miR-671-3p παρατηρήθηκε επίσης και σε δείγματα αρθρικού χόνδρου από ασθενείς με ΟΑ σε σχέση με υγιή άτομα, επιβεβαιώνοντας ότι πρόκειται για κυκλοφορούντα miRNA που υπάρχουν και στο περιβάλλον της ΟΑ άρθρωσης. Βιοπληροφορική ανάλυση του hsa-miR-140-3p ανέδειξε τα σχετιζόμενα με την ΟΑ γονίδια στόχους του. Οι σημαντικότερες πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις του δικτύου που δημιουργήθηκε μεταξύ των γονιδίων στόχων αποκαλύφθηκαν με την ανάλυση της τοπολογίας του δικτύου και με την ανάλυση μονοπατιών-γονιδιακών οντολογιών. Συνεκτιμώντας τις παραπάνω αναλύσεις βιοπληροφορικής, προέκυψε ότι το PTEN αποτελεί ένα γονίδιο που εμφάνισε έναν από τους υψηλότερους βαθμούς συνδεσιμότητας στο δίκτυο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων (PPI, protein-protein interactions) και με συμμετοχή σε πολλαπλές σηματοδοτήσεις/διαδικασίες σημαντικές για την OA.Περαιτέρω, η μελέτη της 3’ UTR του mRNA του PTEN για την εύρεση λειτουργικών θέσεων σύνδεσης του hsa-miR-140-3p, με τη χρήση του εργαλείου βιοπληροφορικής TargetScanHuman 8.0, έδειξε την ύπαρξη αλληλουχιών, οι οποίες αναγνωρίζονται από το miR-140-3p μέσω των οποίων ασκεί τη δράση του στο ΡΤΕΝ. Συγκεκριμένα, βρέθηκαν δύο συμπληρωματικές αλληλουχίες για το miR-140-3p στη 3'UTR του PTEN, στη θέση 1763-1769 και θέση 2882-2888. Χορήγηση του miR-140-3p mimic για 72 ώρες (100 nm) σε καλλιέργειες ΟΑ χονδροκυττάρων έδειξε σημαντική μείωση των επιπέδων της mRNA έκφρασης του PTEN σε σχέση με αυτά που δεν τους χορηγήθηκε. Τα παραπάνω αποτελέσματα σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα που έδειξαν αυξημένη μεταγραφική έκφραση του PTEN και μειωμένη έκφραση του hsa-miR-140-3p στα οστεοαρθριτικά χονδροκύτταρα σε σχέση με τα φυσιολογικά, αναδεικνύουν την αντιστρόφως ανάλογη σχέση μεταξύ του miR-140-3p και του PTEN, το ρόλο του miR-140-3p στη ρύθμιση της έκφρασης του PTEN και ένα πιθανό μοριακό μηχανισμό ο οποίος συμβάλλει στη διαφοροποιημένη έκφραση του PTEN στον ΟΑ χόνδρο. Επιπλέον, η χορήγηση του miR-140-3p mimic σε καλλιέργειες ΟΑ χονδροκυττάρων, επέφερε σημαντική μείωση των επιπέδων της mRNA έκφρασης των γονιδίων HMGCR, HDAC4 και ΜΜΡ-13 και αύξηση της mRNA έκφρασης του γονιδίου BCL-2, σε σχέση με αυτά που δεν τους χορηγήθηκε το hsa-miR-140-3p. Συμπερασματικά, αναδείχθηκε μια υπογραφή τριών miRNA (hsa-miR-140-3p, hsa-miR-671-3p και hsa-miR-33b-3p) στον ορό ασθενών με ΟΑ με τη χρήση μικροσυστοιχιών miRNAs. Αυτά τα miRNAs θα μπορούσαν να αποτελέσουν πιθανούς βιοδείκτες για την αξιολόγηση του κινδύνου και της εξέλιξης της ΟΑ. Επιπρόσθετα, αναδείχθηκε το hsa-miR-140-3p εκτός από βιοδείκτης και ως πιθανός θεραπευτικός στόχος για την οστεοαρθρίτιδα. Η χρήση αναστολέων ή μιμητικών μορίων των miRNAs έχει αποδειχθεί ότι έχει θεραπευτικά οφέλη σε προκλινικά (ζωικά) μοντέλα της νόσου, υποδεικνύοντας ότι αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την αναστολή της εξέλιξης της ΟΑ σε πρώιμα στάδια.