Αλληλεπιδράσεις του φωτοσυνθετικού μηχανισμού των μικροφυκών με το εξωκυτταρικό περιβάλλον, το ηλεκτρικό πεδίο και το υδρογόνο: βιοτεχνολογικές προοπτικές

Abstract

The interactions of the photosynthetic process and in general the cellular metabolism of microalgae with the extracellular water environment (exchange of H+ and e- - Chapters I and II) and their gaseous environment (exposure to extreme atmospheres, oxygenic and anoxic - Chapters III and IV ), are presented and thoroughly analyzed in the four chapters of this Doctoral Thesis: CHAPTER I: The microalgae photosynthetic process and the extracellular proton environment interact with each other. The photosynthetic process of microalgae causes an increase in pH in the culture medium as a result of cellular proton pumping rather than the effect of CO2fixation. Photosynthetic water photolysis and the plastoquinone reduction/oxidation cycle provide protons in the lumen. Biological weak bases, such as polyamines, act as "permeable buffers" in the lumenduring the photosynthetic process, converting ΔpH to Δψ. This is probably the main reason for the continuous light-driven uptake of protons from the culture medium, through the cytoplasm and stroma, into the lumen. The rate of proton uptake and thus microalgal growth is proportional to light intensity, cell concentration, and extracellular proton concentration. Low pH in microalgal cultures, without light and nutrient limitations, strongly induces photosynthesis (and proton uptake) and, consequently, growth. In contrast, the mitochondrial respiratory process, in the absence of photosynthetic activity, does not substantially changethe pH of the culture. The intensification of the respiration process by exogenous supply of glucose leads to significantly reduced pH values in the culture medium, almost exclusively through the production of protons. Increased concentrations of atmospheric CO2 dissolves in the water causing the "ocean acidification" effect by inhibiting the calcification process, very important for many phytoplankton and zooplankton organisms, but also for corals. The proposed new approach to the interaction of microalgal photosynthetic activity with proton concentration in the aquatic environment, independent of CO2 concentration, may be the Ariadne's thread to solve in the near future central environmental problems related to ocean acidification. CHAPTER II: Given the above approach (of chapter I) we then raised the following question: If cells are able to produce a potential difference through photosynthesis, what would happen if we provided an electric current to photosynthesis (photosynthetic electron flow)? The idea to supply electrons of artificial origin (electric current) to the photosynthetic electron transport chain was realized by placing photosynthetic microalgae in an electrolytic assembly of an electro-photobioreactor [E(P)BR]. The results after a series of experimental approaches for the regulation of the concentration of nutrients and cells (regulation of electron conductivity) in relation to the supply of a constant intensity of electric current in microalgae culture highlighted the compatibility of channeling electric current in a biological chain of electron transport, such as that of photosynthesis process (and the respiratory process), inducing it significantly. Not only was the photosynthetic activity accelerated by the supply of appropriate current intensity, but also the production rate of bio-hydrogen (H2) was significantly increased under selected electric field conditions, proving that the additional (beyond electrolysis) hydrogen is of biological origin. The use of a special E(P)BR reactor with individual compartmentalization of the culture allows us to monitor the production of biohydrogen at the anode electrode, the cathode electrode and the space between the two electrodes. That allows us to discuss a possible bio-hydrogen production mechanism of hydrogen in an electric field. Combinedhuman technology (electricity) with biology (photosynthetic and respiratory electron flow) opens up a new field of research with two main perspectives. The first concerns the use of photosynthetic microalgae to increase the efficiency of the electrolytic process in terms of hydrogen production (through the significant additional production of bio-hydrogen) making it energetically advantageous, and the second concerns a new perspective of rapid activation of the photosynthetic mechanism aiming to increase the biomass for its use for biotechnological purposes. CHAPTER III: The interaction of protons (Chapter I) and electrons (Chapter II) with the photosynthetic mechanism of microalgae in a closed system indirectly highlighted the role of gas phase composition in photosynthesis. Therefore, in this chapter we examined the strategy of microalgae to cope with different atmospheres. The present study examines the survival strategy of microalgae in closed systems with anoxic atmospheres and the possibility of creating an oxygenic atmosphere through the photosynthetic management of solar radiation. The complete absence of CO2 appears to be dealt with by the microalga initially by catabolizing cellular organic matter through the respiration process (probably using NO2 instead of O2), which produces CO2. This CO2 supports the photosynthetic process, which produces O2, part of which is mainly used to enrich the atmosphere with O2 and the rest for the respiration process and biomass production. Microalgae showed tolerance to exogenously supplied extreme CO2 concentrations (1%-40%) in an anoxic atmosphere and exhibited significantly higher photosynthetic activity compared to that of microalgae cultures grown in an oxygenic atmosphere. This response of microalgae to extremely high CO2 concentrations under anoxic conditions immediately enhances the atmospheric O2 level as well as culture growth without signs of stress. Since this microalgae strategy is particularly efficient at sequestering CO2 in a CO2-rich atmosphere, it could help combat the greenhouse effect by incorporating microalgae cultures into gas detoxification systems with extremely high CO2 concentrations. The ability of microalgae to rapidly convert hostile atmospheres into O2-rich atmospheres could be used in the future to continuously recycle the atmosphere of human facilities on other planets. Furthermore, the increase of microalgae biomass under these conditions is an ideal combination for important (astro)biotechnological applications. CHAPTER IV: As an extension of the results of chapter III was the investigation of the effect of an absolute H2 atmosphere on the photosynthetic organisms. The specificity of the effect of the H2 atmosphere on the photosynthetic organism and by extension on the entire cellular metabolism, forced us to check it separately. The exposure of microalgae and other (micro)organisms to an absolute hydrogen atmosphere stops both the photosynthetic and respiratory processes and, by extension, the complete cellular metabolism, stopping cellular growth for the desired period of time, extending their survival for long periods of time intervals and at the same time making them resistant to any stress conditions(metabolic arrest). The addition of oxygen or air restores completely the metabolic rate almost immediately and cell growth resumes normally from where it had stopped. Metabolism is the sum total of all the chemical reactions in life-sustaining organisms. There is an ongoing effort to control metabolic rate, which correlates with maximum lifespan potential and is one of the oldest scientific questions. In the present approach, we report for the first time the complete cessation of cellular metabolism and consequently cellular growth (metabolic arrest) of a range of organisms from microalgae to yeasts upon exposure to a 100% hydrogen atmosphere. Metabolic recovery is immediate with minimal O2 addition. Molecular dynamics simulations were used to decipher this phenomenon at the atomic scale. Several protein complexes, related to both photosynthetic and respiratory processes (LHCII, cytochrome c5, alanine dipeptide) were investigated for interaction with a 100% H2 atmosphere. Exposure to hydrogen, unlike oxygen, reduces protein residue fluctuations indicating thermostability. The whole phenomenon is not only limited to microorganisms, such as microalgae, but can also be extended to other (micro)organisms, but also to the preservation of a range of plant and other products (e.g. vegetables, fruits, ... etc.), opening new innovative paths of biotechnological applications.

Οι αλληλεπιδράσεις της φωτοσυνθετικής διαδικασίας και γενικά του κυτταρικού μεταβολισμού των μικροφυκών με το εξωκυτταρικό υδάτινο (ανταλλαγή Η+ αλλά και e- – Κεφάλαιο Ι και ΙΙ) και αέριο περιβάλλον τους (έκθεση σε ακραίας σύστασης ατμόσφαιρες, οξυγονικές και ανοξικές – Κεφάλαιο ΙΙΙ και IV), παρουσιάζονται και αναλύονται διεξοδικά στα τέσσερα κεφάλαια της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής: ΚΕΦΑΛΑΙΟ I: Η φωτοσυνθετική διαδικασία μικροφυκών και το εξωκυτταρικό περιβάλλον πρωτονίων αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Η φωτοσύνθεση προκαλεί αύξηση του pH στο μέσο καλλιέργειας ως αποτέλεσμα της κυτταρικής άντλησης πρωτονίων και όχι της επίδρασης της δέσμευσης CO2. Η φωτοσυνθετική διάσπαση νερού και ο κύκλος αναγωγής/οξείδωσης της πλαστοκινόνης παρέχουν πρωτόνια στο μικροχώρο. Βιολογικές ασθενείς βάσεις, όπως οι πολυαμίνες, δρουν ως «διαπερατά ρυθμιστικά» στον μικροχώρο του θυλακοειδούς κατά τη διάρκεια της φωτοσυνθετικής διαδικασίας, μετατρέποντας το ΔpH σε Δψ. Αυτός είναι πιθανώς ο κύριος λόγος για τη συνεχή πρόσληψη πρωτονίων με γνώμονα το φως από το μέσο καλλιέργειας, μέσω του κυτοπλάσματος και του στρώματος, στον μικροχώρο, που στη συνέχεια μέσω της φωτοσυνθετικής δέσμευσης του CO2 θα καταλήξουν σε μόρια γλυκόζης. Ο ρυθμός πρόσληψης πρωτονίων και, επομένως, η ανάπτυξη μικροφυκών είναι ανάλογος με την ένταση του φωτός, τη συγκέντρωση των κυττάρων και την εξωκυτταρική συγκέντρωση πρωτονίων. Το χαμηλό pH στις καλλιέργειες μικροφυκών, χωρίς περιορισμούς φωτός και θρεπτικών συστατικών, επάγει έντονα τη φωτοσύνθεση (και την πρόσληψη πρωτονίων) και, κατά συνέπεια, την ανάπτυξη. Αντίθετα, η μιτοχονδριακή αναπνευστική διαδικασία, ελλείψει φωτοσυνθετικής δραστηριότητας, δεν διαφοροποιεί ουσιαστικά το pH της καλλιέργειας. Η εντατικοποίηση της διαδικασίας αναπνοής με εξωγενή παροχή γλυκόζης, οδηγεί σε σημαντικά μειωμένες τιμές pH στο μέσο καλλιέργειας, σχεδόν αποκλειστικά μέσω της παραγωγής πρωτονίων. Αυξημένες συγκεντρώσεις ατμοσφαιρικού CO2 διαλύονται στο νερό προκαλώντας το φαινόμενο «οξίνιση των ωκεανών» εμποδίζοντας τη διαδικασία της ασβεστοποίησης, γεγονός πολύ σημαντικό για πολλούς οργανισμούς φυτοπλαγκτού και ζωοπλαγκτού, αλλά και για τα κοράλλια. Η προτεινόμενη νέα προσέγγιση στην αλληλεπίδραση της φωτοσυνθετικής δραστηριότητας μικροφυκών με τη συγκέντρωση πρωτονίων στο υδάτινο τους περιβάλλον, που είναι ανεξάρτητη από τη συγκέντρωση CO2, μπορεί να αποτελέσει το νήμα της Αριάδνης για την επίλυση στο εγγύς μέλλον κεντρικών περιβαλλοντικών προβλημάτων που σχετίζονται με την οξίνιση των ωκεανών. ΚΕΦΑΛΑΙΟ II: Με δεδομένη την παραπάνω προσέγγιση (του κεφαλαίου I) αναδείχθηκε στη συνέχεια το παρακάτω ερώτημα: Αν τα κύτταρα είναι σε θέση να παράγουν διαφορά δυναμικού μέσω της φωτοσύνθεσης, τι θα γινόταν αν παρείχαμε εμείς ηλεκτρικό ρεύμα στη φωτοσύνθεση (φωτοσυνθετική ροή ηλεκτρονίων); Η ιδέα να παρέχουμε ηλεκτρόνια τεχνητής προέλευσης (ηλεκτρικό ρεύμα) στη φωτοσυνθετική αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων έγινε πράξη με την τοποθέτηση φωτοσυνθετικών μικροφυκών σε μία ηλεκτρολυτική διάταξη ενός ηλεκτρο-φωτοβιοαντιδραστήρα [E(P)BR]. Τα αποτελέσματα μετά από σειρά πειραματικών προσεγγίσεων για την ρύθμιση της συγκέντρωσης των θρεπτικών και των κυττάρων (ρύθμιση αγωγιμότητας ηλεκτρονίων) σε σχέση με την παροχή σταθερής έντασης ηλεκτρικού ρεύματος σε καλλιέργεια μικροφυκών ανέδειξαν τη συμβατότητα διοχέτευσης ηλεκτρικού ρεύματος σε μία βιολογική αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων, όπως αυτή της φωτοσυνθετικής και της αναπνευστικής διαδικασίας, επάγοντας την σημαντικά. Όχι μονό επιταχύνθηκε η φωτοσυνθετική απόδοση με την παροχή κατάλληλης έντασης ρεύματος, αλλά επίσης παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση του ρυθμού παραγωγής υδρογόνου (H2) σε επιλεγμένες συνθήκες ηλεκτρικού πεδίου, αποδεικνύοντας ότι το πρόσθετο (πέραν αυτού της ηλεκτρόλυσης) υδρογόνο είναι βιολογικής προέλευσης (βιο-υδρογόνο). Η χρήση ειδικού αντιδραστήρα E(P)BR με επιμέρους διαμερισματοποίηση της καλλιέργειας μας επιτρέπει να παρακολουθούμε την παραγωγή βιο-υδρογόνου στο ηλεκτρόδιο της ανόδου, στο ηλεκτρόδιο της καθόδου και στον χώρο μεταξύ των δύο ηλεκτροδίων και μας δίνει τη δυνατότητα να συζητήσουμε για πιθανό μηχανισμό παραγωγής βιο-υδρογόνου σε ηλεκτρικό πεδίο. Συνδυάζοντας την τεχνολογία (ηλεκτρικό ρεύμα) με τη βιολογία (φωτοσυνθετική και αναπνευστική ροή ηλεκτρονίων) ανοίγεται ένα νέο πεδίο έρευνας με δύο βασικές προοπτικές. Η πρώτη, αφορά τη χρήση φωτοσυνθετικών μικροφυκών για την αύξηση της απόδοσης της ηλεκτρολυτικής διαδικασίας όσον αφορά την παραγωγή υδρογόνου (μέσω και της σημαντικής επιπρόσθετης παραγωγής βιο-υδρογόνου) καθιστώντας την ενεργειακά συμφέρουσα, και η δεύτερη, αφορά μια νέα προοπτική ταχύτατης «αναζωογόνησης» του φωτοσυνθετικού μηχανισμού αποσκοπώντας στην αύξηση της βιομάζας για τη χρήση της για μελλοντικούς βιοτεχνολογικούς σκοπούς. ΚΕΦΑΛΑΙΟ III: Η αλληλεπίδραση πρωτονίων (Κεφάλαιο Ι) και ηλεκτρονίων (Κεφάλαιο ΙΙ) με το φωτοσυνθετικό μηχανισμό των μικροφυκών σε ένα κλειστό σύστημα, ανέδειξαν εμμέσως και τον ρόλο της σύστασης των αερίων στην φωτοσύνθεση. Ως εκ τούτου, στο παρόν κεφάλαιο εξετάσαμε τη στρατηγική των μικροφυκών να ανταπεξέλθουν σε διαφορετικής σύστασης ατμόσφαιρες. Η παρούσα μελέτη εξετάζει τη στρατηγική επιβίωσης των μικροφυκών σε κλειστά συστήματα με ανοξικές ατμόσφαιρες και τη δυνατότητα δημιουργίας οξυγονικής ατμόσφαιρας μέσω της φωτοσυνθετικής διαχείρισης της ηλιακής ακτινοβολίας. Η πλήρης απουσία CO2 φαίνεται να αντιμετωπίζεται από το μικροφύκος αρχικά με τον καταβολισμό της κυτταρικής οργανικής ύλης μέσω της αναπνευστικής διαδικασίας (πιθανόν χρησιμοποιώντας NO2 αντί για O2), η οποία παράγει CO2. Αυτό το CO2 υποστηρίζει τη φωτοσυνθετική διαδικασία, η οποία παράγει O2, μέρος του οποίου χρησιμοποιείται κυρίως για τον εμπλουτισμό της ατμόσφαιρας με O2 και το υπόλοιπο για την αναπνευστική διαδικασία και την παραγωγή βιομάζας. Τα μικροφύκη έδειξαν ανοχή σε εξωγενώς παρεχόμενες ακραίες συγκεντρώσεις CO2 (1%-40%) σε ανοξική ατμόσφαιρα και εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερη φωτοσυνθετική δραστηριότητα σε σύγκριση με αυτή των καλλιεργειών μικροφυκών που καλλιεργήθηκαν σε οξυγονική ατμόσφαιρα. Αυτή η απόκριση των μικροφυκών σε εξαιρετικά υψηλές συγκεντρώσεις CO2 υπό ανοξικές συνθήκες ενισχύει αμέσως το επίπεδο του O2 στην ατμόσφαιρα καθώς και την ανάπτυξη της καλλιέργειας χωρίς ενδείξεις καταπόνησης. Δεδομένου ότι αυτή η στρατηγική των μικροφυκών είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στη δέσμευση του CO2 σε ατμόσφαιρα πλούσια σε CO2, θα μπορούσε να βοηθήσει στην καταπολέμηση του φαινομένου του θερμοκηπίου, ενσωματώνοντας καλλιέργειες μικροφυκών σε συστήματα αποτοξικοποίησης αερίων με εξαιρετικά υψηλές συγκεντρώσεις CO2. Η ικανότητα των μικροφυκών να μετατρέπουν γρήγορα τις εχθρικές για τον άνθρωπο ατμόσφαιρες σε ατμόσφαιρες πλούσιες σε Ο2 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στο μέλλον για τη συνεχή ανακύκλωση της ατμόσφαιρας ανθρώπινων εγκαταστάσεων σε άλλους πλανήτες. Επιπλέον, η αύξηση της βιομάζας των μικροφυκών υπό αυτές τις συνθήκες αποτελεί ιδανικό συνδυασμό για σημαντικές (αστρο)βιοτεχνολογικές εφαρμογές. ΚΕΦΑΛΑΙΟ IV: Ως προέκταση των αποτελεσμάτων του κεφαλαίου III ήταν ο έλεγχος της επίδρασης μίας απόλυτης ατμόσφαιρας Η2 στο φωτοσυνθετικό οργανισμό. Η ιδιαιτερότητα της επίδρασης της ατμόσφαιρας Η2 στο φωτοσυνθετικό οργανισμό και κατ' επέκταση σε όλο τον κυτταρικό μεταβολισμό, μας ανάγκασε να την ελέγξουμε ξεχωριστά. Η έκθεση μικροφυκών και άλλων (μικρο)οργανισμών σε απόλυτη ατμόσφαιρα υδρογόνου (100% Η2) σταματά τόσο τη φωτοσυνθετική, όσο και την αναπνευστική διαδικασία και κατ’ επέκταση όλο τον κυτταρικό μεταβολισμό σταματώντας και την κυτταρική ανάπτυξη για το χρονικό διάστημα που επιθυμούμε, επεκτείνοντας την επιβίωση τους για μεγάλα χρονικά διαστήματα και καθιστώντας τους ταυτόχρονα ανθεκτικούς σε οποιαδήποτε μορφή καταπόνησης (στάση μεταβολισμού). Η ελάχιστη προσθήκη οξυγόνου ή αέρα επαναφέρει πλήρως (κατά 100%) σχεδόν άμεσα τον μεταβολικό ρυθμό και η ανάπτυξη των κυττάρων συνεχίζεται κανονικά από το σημείο που είχε σταματήσει. Ο μεταβολισμός είναι το άθροισμα όλων των χημικών αντιδράσεων στους οργανισμούς που συντηρούν τη ζωή. Υπάρχει μια συνεχής προσπάθεια για τον έλεγχο του μεταβολικού ρυθμού, ο οποίος συσχετίζεται με το μέγιστο δυναμικό διάρκειας ζωής και αποτελεί ένα από τα παλαιότερα επιστημονικά ερωτήματα. Στην παρούσα προσέγγιση, αναφέρουμε για πρώτη φορά την πλήρη παύση του κυτταρικού μεταβολισμού και κατά συνέπεια την κυτταρική ανάπτυξη (μεταβολική στάση) μιας σειράς οργανισμών, από μικροφύκη έως ζυμομύκητες κατά την έκθεση τους σε ατμόσφαιρα υδρογόνου 100%. Η αποκατάσταση του μεταβολισμού είναι άμεση με την ελάχιστη προσθήκη Ο2. Για την αποκρυπτογράφηση των φυσικών νόμων που διέπουν αυτό το φαινόμενο σε ατομική κλίμακα χρησιμοποιήθηκαν προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής. Διάφορα πρωτεϊνικά σύμπλοκα, που σχετίζονται τόσο με τη φωτοσυνθετική, όσο και με την αναπνευστική διαδικασία (LHCII, κυτόχρωμα c5, διπεπτίδιο αλανίνης) διερευνήθηκαν ως προς την αλληλεπίδραση με το υδρογόνο. Η έκθεση στο υδρογόνο, σε αντίθεση με το οξυγόνο, μειώνει την κινητικότητα των πρωτεϊνικών καταλοίπων υποδηλώνοντας θερμοσταθερότητα. Το όλο φαινόμενο δεν περιορίζεται μόνο στα μικροφύκη, αλλά μπορεί να επεκταθεί και σε άλλους (μικρο)οργανισμούς, αλλά και στη συντήρηση μίας σειράς φυτικών και άλλων προϊόντων (π.χ. λαχανικά, φρούτα, … κ.α.), ανοίγοντας νέους καινοτόμους δρόμους βιοτεχνολογικών εφαρμογών.