Study of the role of CYLD in somatic cell reprogramming and directed differentiation

Abstract

Somatic cell reprogramming is a process through which any cell type can be transformed into an induced pluripotent stem cell. The most well studied methodology used involves the overexpression of four transcription factors (OCT4, SOX2, KLF4, cmyc) which are commonly known as the Yamanaka factors. Even though, great progress has been made in understanding the mechanisms governing reprogramming, many regulatory elements still remain elusive. CYLD is a protein which primarily functions as a deubiquitinating enzyme (DUB) that targets mostly K63 and M1 ubiquitin chains, thus playing an important role as a modulator of cell signaling. Consequently, CYLD is involved in numerous biological processes, such as angiogenesis, cell cycle regulation and the immune response. Furthermore, it acts as a tumor suppressor gene and CYLD DUB deficiency is linked with both cancer development and disease progression. Many signaling pathways and processes regulated by CYLD are involved in somatic cell reprogramming, however the potential role of CYLD in this process has not been studied yet. The aim of the current thesis, is to investigate the potential role of CYLD in somatic cell reprogramming, the pluripotency maintenance of produced iPSCs and their spontaneous differentiation potential. For that purpose, CYLD-DUB-deficient mouse embryonic fibroblasts (MEFs) capable of expressing wild type (CYLD WT/WT) or catalytically inactive (CYLD Δ9/Δ9) CYLD were reprogrammed through ectopic overexpression of the Yamanaka factors. CYLD Δ9/Δ9 MEFs expressing the Δ9 CYLD allele (which encodes a truncated, catalytically inactive protein) presented a 75% reduction in reprogramming efficiency compared to WT MEFs. However, the introduction of WT CYLD in Δ9 MEFs was able to revert reprogramming efficiency to normal levels. Expression of markers representative of the phases of reprogramming (day 5 for early, day 10 for intermediate and day 16 for late reprogramming) identified the first phase (also known as initiation phase) as being mostly affected by CYLD DUB deficiency. Through gene expression and whole proteomic analysis, it was revealed that CYLD DUB deficiency promotes the expression of genes related to somatic cell identity, extracellular matrix (ECM) and Epithelial-to-Mesenchymal transition (EMT), therefore inhibiting the opposing process known as Mesenchymal-to-Epithelial transition (MET) an important milestone of early reprogramming. As a result, the activation and subsequent upregulation of genes related to successful reprogramming (such as epithelial and early pluripotency genes) is blocked and CYLD-DUB-deficient cells are characterized by slower kinetics of early reprogramming progression. Regardless, Δ9 MEFs managed to produce stable iPSC cell lines that presented similar phenotypic characteristics to those of WT iPSCs. Importantly, the expression of pluripotency markers was comparable between Δ9 and WT iPSCs. On the other hand, both expressed low levels of fibroblast and differentiation-associated markers, which are indicative of full pluripotency. The differentiation potential of both type iPSC lines was assessed through an in vitro spontaneous differentiation protocol. Interestingly, they were able to produce cells derived from all 3 embryonic germ layers (endoderm, mesoderm, ectoderm). Moreover, the kinetics of differentiation, as measured through the 16 expression of lineage markers during the course of the process, presented no difference between WT and Δ9 iPSCs. Based on these results, in was concluded that CYLD DUB deficiency is dispensable for pluripotency maintenance and doesn’t affect the spontaneous differentiation potential of iPSCs. The results of this thesis revealed for the first time the important regulatory role of CYLD in somatic cell reprogramming and, at the same time, provided further evidence concerning the connection of CYLD DUB deficiency to EMT promotion. The association of CYLD with the extracellular matrix is another significant discovery of this study.

Ο επαναπρογραμματισμός σωματικών κυττάρων είναι μια διαδικασία μέσω της οποίας σωματικά διαφοροποιημένα κύτταρα μπορούν να μετατραπούν σε ολοδύναμα βλαστικά κύτταρα (iPSCs). Η πιο καλά μελετημένη μεθοδολογία επαναπρογραμματισμού είναι η έκτοπη έκφραση τεσσάρων μεταγραφικών παραγόντων (OCT4, SOX2, KLF4 και c-myc, επίσης γνωστοί ως παράγοντες Yamanaka) σε εμβρυονικούς ινοβλάστες μυών (MEFs). Η εισαγωγή αυτών των παραγόντων στα κύτταρα επιτυγχάνεται μέσω λεντιϊικής μόλυνσης. Ο επαναπρογραμματισμός σωματικών κυττάρων μπορεί να εφαρμοστεί σε πολυάριθμους τομείς, όπως η μοντελοποίηση ασθενειών, η καρκινογένεση, η γήρανση και η αναγέννηση ιστών. Παρά τη σημαντική πρόοδο που έχει σημειωθεί στην κατανόηση των μηχανισμών που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία, ο επαναπρογραμματισμός παραμένει ένα εξαιρετικά πολύπλοκο φαινόμενο, με μεγάλο αριθμό ετερογενών παραγόντων να ρυθμίζουν τόσο την πρόοδο όσο και την απόδοση του επαναπρογραμματισμού. Μερικά μόνο παραδείγματα περιλαμβάνουν την εμπλοκή πολυάριθμων γονιδίων, μικρών μορίων, σηματοδοτικών μονοπατιών, επιγενετικών τροποποιήσεων και μικρών RNAs (microRNAs). Η κατανόηση τόσο της σημασίας καθενός από αυτούς τους ετερογενείς μηχανισμούς, όσο και της μεταξύ τους αλληλεπίδρασης είναι επιτακτική ανάγκη για την πλήρη αποκρυπτογράφηση του ρυθμιστικού δικτύου του επαναπρογραμματισμού. Το CYLD είναι ένα γονίδιο μήκους 60 kb που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 956 αμινοξέων (CYLD) η οποία λειτουργεί κυρίως ως ένζυμο αποουβικουιτινάσης (DUB). Ως εκ τούτου, η CYLD παίζει σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση της κυτταρικής σηματοδότησης. Η συμβολή της CYLD στη ρύθμιση του NF-κΒ έχει μελετηθεί εκτενώς, όπου φαίνεται να δρα τόσο ως Κ-63 όσο και ως Μ-1 αποουβικουιτινάση. Επιπλέον, η CYLD έχει αποδειχθεί ότι έχει ρυθμιστικό ρόλο και σε άλλα σηματοδοτικά μονοπάτια, συμπεριλαμβανομένων των TGF-β, Wnt-β κατενίνη, Hippo, JNK, ERK και Akt. Όσον αφορά τον βιολογικό της ρόλο, η CYLD έχει μελετηθεί κυρίως όσον αφορά τον ρόλο της στην καρκινογένεση. Έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο, καθώς τόσο η μείωση της έκφρασής όσο και η απώλεια της καταλυτικής δραστικότητας έχουν συσχετιστεί με δυσμενείς επιπτώσεις σε πολλούς τύπους καρκίνου. Παρόλο που μέχρι στιγμής δεν έχει μελετηθεί, η CYLD μπορεί επίσης να έχει ρυθμιστικό ρόλο στον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό. Πράγματι, αρκετά από τα σηματοδοτικά μονοπάτια που ελέγχονται από την CYLD (TGF-β, Hippo και Wnt-β κατενίνη) διαδραματίζουν κρίσιμο μηχανιστικό ρόλο στον επαναπρογραμματισμό. Παράλληλα, διεργασίες όπως η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου, η Επιθηλιακή-προς-Μεσενχγυματική Μετατροπή (ΕΜΤ) και η γλυκολυτική μεταστροφή (glycolytic shift) που είναι καθοριστικής σημασίας για την πρόοδο του επαναπρογραμματισμού, ελέγχονται από την καταλυτική δράση της CYLD. Τέλος, τα ογκοκατασταλτικά γονίδια (στα οποία ανήκει το CYLD) αποτελούν φραγμούς του επαναπρογραμματισμού. Πράγματι, η αναστολή της έκφρασης ογκοκατασταλτικών γονιδίων, όπως του TP53 (p53) και του CDKN1A (p21), μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση της απόδοσης του επαναπρογραμματισμού. Ο πρωταρχικός στόχος αυτής της μελέτης είναι η διερεύνηση του δυνητικού ρόλου του CYLD στον επαναπρογραμματισμό σωματικών κυττάρων, καθώς και στη διατήρηση της ολοδυναμίας και της ικανότητας διαφοροποίησης των παραγόμενων iPSC. Δεδομένου ότι η CYLD δρα κυρίως ως DUB, η επίδραση της καταλυτικής δραστικότητας της CYLD αποτελεί το επίκεντρο αυτής της μελέτης. Για το λόγο αυτό, χρησιμοποιήθηκαν MEFs που εκφράζουν το αλληλόμορφο Δ9 CYLD (CYLDΔ9/Δ9), που κωδικοποιεί μια ατελή μορφή της πρωτεΐνης CYLD από την οποία λείπει το καρβοξυ-τελικό άκρο, συμπεριλαμβανομένου του καταλυτικού κέντρου. Ο επαναπρογραμματισμός των Δ9 MEFs (μέσω έκτοπης υπερέκφραση των παραγόντων Υamanaka) οδήγησε σε 75% μείωση της απόδοσης του επαναπρογραμματισμού σε σύγκριση με τα MEF που εκφράζουν το αγρίου τύπου (WT) CYLD. Είναι ενδιαφέρον ότι η επανέκφραση του WT CYLD σε Δ9 MEFs κατάφερε να αυξήσει την απόδοση του επαναπρογραμματισμού στα επίπεδα των WT MEFs. Ωστόσο, η εισαγωγή της παραλλαγής CYLD C601S, η οποία καθίσταται καταλυτικά ανενεργή μέσω μιας σημειακής μετάλλαξης στο καταλυτικό της κέντρο, σε Δ9 MEFs δεν είχε καμία επίδραση στην απόδοση, παρέχοντας ισχυρές ενδείξεις ότι η CYLD ρυθμίζει τον επαναπρογραμματισμό σωματικών κυττάρων μέσω της δραστικότητας DUB. Παρά τη μείωση που παρατηρήθηκε στην απόδοση του επαναπρογραμματισμού, τα Δ9 MEFs κατάφεραν να σχηματίσουν iPSC αποικίες μετά το πέρας της διαδικασίας. Κατά συνέπεια, εξετάστηκε κατά πόσον τα Δ9 iPSC είναι πλήρως ολοδύναμα κύτταρα. Για τον σκοπό αυτό, iPSC αποικίες WT και Δ9 συλλέχθησαν την ημέρα 18 του επαναπρογραμματισμού και εγκαθιδρύθηκαν σταθερές, μονοκλωνικές κυτταρικές σειρές iPSC. Μετά από 10 διαδοχικές ανακαλλιέργειες, τα Δ9 iPSCs παρουσίασαν παρόμοια μορφολογικά χαρακτηριστικά με τα WT iPSCs. Ταυτόχρονα, και οι δυο κυτταρικές σειρές χαρακτηρίζονται από υψηλά επίπεδα έκφρασης δεικτών ολοδυναμίας (OCT4, NANOG, ESRRB, DPPA5A, REX1, UTF1) και επιθηλιακών δεικτών (CDH1, OCLN) και χαμηλά επίπεδα έκφρασης μεσεγχυματικών (CDH2, SNAI1, ZEB2) ινοβλαστικών (ACTA2, CD44, THY1) και αναπτυξιακών δεικτών (BRACHYURY-T και EOMES), υποδεικνύοντας ότι τόσο τα WT όσο και τα Δ9 iPSCs έχουν παρόμοια ικανότητα διατήρησης του αδιαφοροποίητου χαρακτήρα. Ένα άλλο χαρακτηριστικό γνώρισμα της ολοδυναμίας είναι η ικανότητα των ολοδύναμων βλαστικών κυττάρων να διαφοροποιούνται σε κύτταρα από τις τρεις εμβρυικές βλαστικές στιβάδες (ενδόδερμα, μεσόδερμα, εξώδερμα). Ως εκ τούτου, εξετάστηκε κατά πόσον η ανεπάρκεια της CYLD θα μπορούσε να επηρεάσει αυτή τη διαδικασία. Για τον σκοπό αυτό, WT και Δ9 iPSCs μετασχηματίστηκαν σε εμβρυοειδή σώματα (EBs- δομές που προσομοιάζουν την πρώιμη εμβρυογένεση) και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες αυθόρμητης διαφοροποίησης (in vitro). Στο τέλος της διαδικασίας και οι δύο κυτταρικές σειρές παρουσίασαν συγκρίσιμα επίπεδα ενδοδερμικών (AFP, GATA4), μεσοδερμικών (ACTA2, BRACHYURY) και εξωδερμικών (NESTIN, PAX6) δεικτών. Η κινητική διαφοροποίησης ομοίως δεν παρουσίασε διαφορές. Πιο συγκεκριμένα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν από σημεία-κλειδιά της αυθόρμητης διαφοροποίησης (ημέρες 0-4, 7, 10 και 14) και μελετήθηκε ο ρυθμός μείωσης της έκφρασης των γονιδίων ολοδυναμίας (OCT4, NANOG, DPPA5A, REX1) και ο ρυθμός αύξησης της έκφρασης των αναπτυξιακών γονιδίων (ενδόδερμα: AFP, GATA4, μεσόδερμα: ACTA2, BRACHYURY, εξώδερμα: NESTIN, PAX6, τροφοεξώδερμα: EOMES). Και στις δυο κυτταρικές σειρές τα εξεταζόμενα γονίδια παρουσίασαν συγκρίσιμη κινητική έκφρασης. Συμπερασματικά, η ανεπάρκεια της CYLD δεν επηρεάζει την ολοδυναμία και την in vitro ικανότητα αυθόρμητης διαφοροποίησης των iPSCs. Εν συνεχεία, προσδιορίστηκε η φάση του επαναπρογραμματισμού που επηρεάζεται περισσότερο από την απώλεια της καταλυτικής δραστικότητας της CYLD. Συλλέχθηκαν αποικίες iPSC από τις τέσσερις κυτταρικές σειρές MEF (WT, Δ9, Δ9 FCYLD, Δ9 C601S) κατά τις αντιπροσωπευτικές ημέρες κάθε φάσης (5 για την αρχική, 10 για την ενδιάμεση και για την ύστερη φάση του επαναπρογραμματισμού) και αξιολογήθηκε η έκφραση δεικτών που είναι ειδικοί για την εκάστοτε φάση. Όλες οι κυτταρικές σειρές παρουσίασαν παρόμοια πρότυπα γονιδιακής έκφρασης κατά τις ημέρες 10 και 16, παρουσιάζοντας υψηλά επίπεδα δεικτών πρώιμης και όψιμης ολοδυναμίας (OCT4, SOX2, NANOG, ESRRB, GBX2, DPPA5A, UTF1 και REX1). Ωστόσο, κατά την ημέρα 5, τα κύτταρα με ανεπάρκεια CYLD (Δ9 και C601S) παρουσίασαν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων πρώιμης ολοδυναμίας (OCT, NANOG, ESRRB) καθώς και των επιθηλιακών γονιδίων (CDH1, OCLN, KRT17 και EPCAM), τα οποία θεωρούνται δείκτες της αρχικής φάσης του επαναπρογραμματισμού. Αυτό δείχνει ότι το CYLD παίζει ρυθμιστικό ρόλο κατά τη φάση έναρξης. Είναι ενδιαφέρον ότι η υποέκφραση των μεσεγχυματικών (SNAI1, ZEB2) και ινοβλαστικών (TGFB3, THY1) γονιδίων (ένα άλλο χαρακτηριστικό γεγονός της φάσης έναρξης) δεν επηρεάστηκε από την έλλειψη καταλυτικής δραστικότητας της CYLD, καθώς και οι τέσσερις κυτταρικές σειρές παρουσίασαν παρόμοια επίπεδα έκφρασης κατά την ημέρα 5. Η επίδραση της ανεπάρκειας του CYLD στην φάση έναρξης του επαναπρογραμματισμού διερευνήθηκε περαιτέρω. Δείγματα από τις τέσσερις κυτταρικές σειρές συλλέχθηκαν κατά από την ημέρα έως την ημέρα 6 του επαναπρογραμματισμού και εξετάστηκαν τα επίπεδα έκφρασης αντιπροσωπευτικών δεικτών της φάσης έναρξης. Πιο συγκεκριμένα, η φάση έναρξης χαρακτηρίζεται από σταθερή μείωση της έκφρασης των μεσεγχυματικών και ινοβλαστικών δεικτών και την ταυτόχρονη ενεργοποίηση των επιθηλιακών δεικτών και ορισμένων δεικτών πρώιμης ολοδυναμίας, μια διαδικασία γνωστή ως Μεσεγχυματική-προς-Επιθηλιακή Μετατροπή (MET). Μια άλλη σημαντική πτυχή αυτής της φάσης είναι η ενεργοποίηση της γλυκόλυσης. Καθ' όλη τη διάρκεια της φάσης έναρξης, τα κύτταρα με ανεπάρκεια CYLD εκφράζουν χαμηλότερα επίπεδα τόσο των επιθηλιακών γονιδίων (CDH1, OCLN, KRT17 και EPCAM) όσο και των γονιδίων πρώιμης ολοδυναμίας (OCT, NANOG, ESRRB), υποδεικνύοντας βραδύτερη κινητική της προόδου του επαναπρογραμματισμού. Είναι σημαντικό ότι η παρατήρηση αυτή επαληθεύτηκε τόσο μέσω qPCR, όσο και μέσω μεταγραφωματικής και πρωτεωμικής ανάλυσης WT και Δ9 πρώιμων iPSCs. Από την άλλη πλευρά, όλες οι κυτταρικές σειρές παρουσίασαν χαμηλά επίπεδα μεσεγχυματικών και ινοβλαστικών γονιδίων, ενώ η ενεργοποίηση της γλυκόλυσης ήταν επίσης συγκρίσιμη. Ο πρώιμος επαναπρογραμματισμός μπορεί να διακριθεί σε δύο στάδια, το μεσεγχυματικό και το επιδερμικό στάδιο. Το πρώτο χαρακτηρίζεται από υψηλά επίπεδα μεσεγχυματικών, ινοβλαστικών και αναπτυξιακών γονιδίων. τα οποία στη συνέχεια υποεκφράζονται ραγδαία κατά την έναρξη του επιδερμικού σταδίου. Η ενεργοποίηση των επιθηλιακών γονιδίων σηματοδοτεί την έναρξη του επιδερμικού σταδίου και συμπίπτει με την έναρξη της ΜΕΤ. Με βάση αυτό, δημιουργήθηκε η υπόθεση ότι η απουσία καταλυτικής δράσης της CYLD έπιδρά κυρίως στη μετάβαση από το μεσεγχυματικό στο επιδερμικό στάδιο της φάσης έναρξης του επαναπρογραμματισμού. Πράγματι, τα δείγματα που συλλέχθηκαν από την ημέρα 2 του επαναπρογραμματισμού αποκάλυψαν ότι τα κύτταρα με ανεπάρκεια CYLD εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα μεσεγχυματικών και ινοβλαστικών δεικτών, ενώ αποτυγχάνουν να ενεργοποιήσουν τους επιθηλιακούς δείκτες στο ίδιο χρονικό σημείο με τα κύτταρα που εκφράζουν το WT CYLD. Είναι σημαντικό, ότι η ολική πρωτεωμική ανάλυση αυτού του σταδίου επιβεβαίωσε τις παραπάνω παρατηρήσεις. Επιπλέον, ανακαλύφθηκε ότι τα κύτταρα με ανεπάρκεια CYLD υπερεκφράζουν έναν αριθμό πρωτεϊνών που σχετίζονται με την πρόοδο της EMT (η αντίστροφη διεργασία της ΜΕΤ), ενώ ένα υποσύνολο από αυτές εμπλέκεται στην οργάνωση της εξωκυττάριας μήτρας (ECM), που επίσης έχει συνδεθεί με την παρεμπόδιση της προόδου του επαναπρογραμματισμού. Από την άλλη πλευρά, τα επιθηλιακά γονίδια, καθώς και τα γονίδια που σχετίζονται με τον επιτυχή επαναπρογραμματισμό, παρουσιάζουν σημαντική υποέκφραση στα κύτταρα με ανεπάρκεια CYLD σε σύγκριση με τα WT CYLD κύτταρα. Συμπερασματικά, το CYLD είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της προόδου του επαναπρογραμματισμού, δρώντας κατά βάση στην φάση έναρξης. Η ανεπάρκεια του CYLD έχει προάγει την EMT, γεγονός που παρεμποδίζει την ΜΕΤ και ως αποτέλεσμα, προκαλεί επιβράδυνση της προόδου του επαναπρογραμματισμού. Επιπλέον, αυτή η μελέτη αποκάλυψε έναν νέο ρόλο της CYLD ως ρυθμιστή της οργάνωσης της εξωκυτταρικής μήτρας. Τα ευρήματα αυτά συσχετίζονται με προηγούμενες μελέτες που συνέδεσαν την ανεπάρκεια CYLD με την ΕΜΤ, μέσω των σηματοδοτικών μονοπατιών TGF-β και Hippo (YAP/TAZ).