The role of SOX2 in regulation of pluripotency and early cell fate decisions in embryos and embryonic stem cells

Abstract

The transcription factor Sox2 (SRY-related HMG box gene 2) plays a pivotal role in maintaining self-renewal and pluripotency in embryonic stem (ES) cells derived from the inner cell mass (ICM) of the embryo. Previously it was shown that Sox2-/mouse embryos die soon after implantation, however, maternal Sox2 transcripts may mask an earlier phenotype. This study has shown that siRNA knock-down of Sox2 at the 2-cell stage of the preimplantation mouse embryo results in embryo arrest at the morula stage, increased cellular apoptosis and loss of ability to generate the first differentiated tissue in the embryo, the trophectoderm (TE). Loss of TE probably results from lack of Fgf4-Fgfr2 signaling or because Sox2 directly activates Cdx2. This novel result suggests a much earlier role for Sox2 than previously reported. While expression of stem-related genes such as Oct4 and Nanog was retained in the RNAi-induced absence of Sox2, molecules required for commitment to trophectoderm (Cdx2, Eomes, Fgfr2 and Fgf4) or establishment of the trophectoderm epithelium (Occludin) were lost and blastocyst formation was prevented (only 18.7-21% embryos formed blastocysts). Knock-down of Sox2 in mouse ES cells using shRNA plasmid vectors resulted in alterations in the expression of a number of genes associated with pluripotency, commitment to trophectoderm, mesendoderm, neuroectoderm and cell-cycle regulation. The most striking impact of knocking down Sox2 in mES cells was the significant upregulation of the trophectoderm markers Cdx2 and Eomes, and of the mesendoderm markers Mixl1, Goosecoid and Brachyury. In a culture environment designed to promote neurogenesis, Sox2 shRNA cells acquired a more glial (astrocytic) phenotype. Absence of Sox2 resulted in a severe compromise of ES cell growth rate, loss of self renewal and cell-cycle arrest, in the absence of increased apoptosis. SOX2 shRNA knock-down in hES cells resulted in loss of pluripotency markers, and upregulation of trophectoderm and mesendoderm markers. The above findings suggest that while Sox2 in the early mouse embryo induces TE formation and is essential for the developmental transition from the morula to the blastocyst stage, in mES and hES cells it acts to maintain selfrenewal and inhibit trophectoderm and mesendoderm differentiation.

Ο μεταγραφικός παράγοντας Sox2 (SRY-σχετιζόμενο γονίδιο 2 με κουτί ομάδας υψηλής κινητικότητας) παίζει έναν καθοριστικό ρόλο στη διατήρηση της αναγεννητικότητας και ολοδυναμικότητας των εμβρυονικών βλαστοκυττάρων προερχόμενων από την εσωτερική κυτταρική μάζα του εμβρύου. Προηγουμένως είχε αποδειχθεί ότι Sox2 -/έμβρυα ποντικού πεθαίνουν λίγο μετά την εμφύτευση, ωστόσο, μητρικά μεταγραφικά προϊόντα του Sox2 μπορούν να επικαλύπτουν έναν νωρίτερο φαινότυπο. Η παρούσα μελέτη έχει δείξει ότι η αποσιώπηση του Sox2 με siRNA στο στάδιο των 2 κυττάρων του προεμφυτευτικού εμβρύου ποντικού έχει ως αποτέλεσμα διακοπή της ανάπτυξης στο στάδιο του μοριδίου, αυξημένη κυτταρική απόπτωση και απώλεια της ικανότητας δημιουργίας του πρώτου διαφοροποιημένου ιστού στο έμβρυο, του τροφοεξωδέρματος. Η απώλεια του τροφοεξωδέρματος πιθανά προκύπτει από την έλλειψη των μηνυμάτων Fgf4-Fgfr2 ή επειδή το Sox2 ενεργοποιεί απευθείας το Cdx2. Αυτό το καινοτόμο αποτέλεσμα προτείνει έναν πολύ νωρίτερο ρόλο για το Sox2 από ό,τι είχε προηγουμένως αναφερθεί. Ενώ η έκφραση βλαστο-σχετιζόμενων γονιδίων όπως το Oct4 και το Nanog διατηρήθηκε κατά την RNAi-επαγώμενη απώλεια του Sox2, μόρια απαιτούμενα για τη γένεση του τροφοεξωδέρματος (Cdx2, Eomes, Fgfr2 και Fgf4) ή την καθιέρωση του επιθηλίου της τροφοβλάστης (Occludin), χάθηκαν, και η διαμόρφωση της βλαστοκύστης αναχαιτίστηκε (μόνο το 18.7-21% των εμβρύων σχημάτισαν βλαστοκύστεις). Η αποσιώπηση του Sox2 σε εμβρυονικά βλαστοκύτταρα ποντικού, χρησιμοποιώντας πλασμιδιακούς φορείς shRNA, είχε ως συνέπεια τροποποιήσεις στην έκφραση αρκετών γονιδίων σχετιζόμενων με την ολοδυναμικότητα, τη γένεση του τροφοεξωδέρματος, του μεσο-/ενδοδέρματος, του νευροεξωδέρματος και τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Το πιο εντυπωσιακό αποτύπωμα της αποσιώπησης του Sox2 σε εμβρυονικά βλαστοκύτταρα ποντικού ήταν η σημαντική αύξηση στα επίπεδα έκφρασης των δεικτών τροφοεξωδέρματος Cdx2 και Eomes, και των δεικτών μεσο-/ενδοδέρματος Mixl1, Goosecoid και Brachyury. Σε ένα περιβάλλον καλλιέργειας σχεδιασμένο να προωθεί τη νευρογένεση, τα Sox2 shRNA κύτταρα, απέκτησαν έναν φαινότυπο νευρογλοίας με περισσότερα αστροκύτταρα. Η απουσία του Sox2 είχε ως αποτέλεσμα μια σοβαρή αναχαίτιση του αυξητικού ρυθμού των εμβρυονικών βλαστοκυττάρων, απώλεια αναγεννητικότητας και διακοπή κυτταρικού κύκλου, απουσία αυξημένης απόπτωσης. Η αποσιώπηση με shRNA του SOX2 σε ανθρώπινα εμβρυονικά βλαστοκύτταρα, είχε ως συνέπεια την απώλεια δεικτών ολοδυναμικότητας και την αύξηση επιπέδων έκφρασης δεικτών τροφοεξωδέρματος και μεσο-/ενδοδέρματος. Τα παραπάνω ευρήματα προτείνουν ότι ενώ το Sox2 στο πρώιμο έμβρυο ποντικού επάγει τη διαμόρφωση του τροφοεξωδέρματος και είναι απαραίτητο για την αναπτυξιακή μετάβαση από το μορίδιο στο στάδιο της βλαστοκύστης, στα εμβρυονικά βλαστοκύτταρα ποντικού και ανθρώπου ενεργεί για να διατηρήσει την αναγεννητικότητα και να αναχαιτίσει τη διαφοροποίηση σε τροφοβλάστη και μεσό-ενδόδερμα.