Πειραματική μελέτη για την πρόληψη της καμπυλοβακτηρίωσης με τη χορήγηση μίγματος οξέων στα κρεοπαραγωγά ορνίθια

Abstract

Bacteria of the genus Campylobacter are recognized as the leading causes of human bacterial foodborne gastroenteritis worldwide, and campylobacteriosis ranks first among the zoonoses recorded in the European Union, with over 220,000 cases in 2019. Poultry meat, and especially that of broilers, is considered the most common source of human infection, and Campylobacter jejuni (C. jejuni) is the species involved in the majority of the reported cases. It is estimated that 60-80% of the commercial broiler flocks are positive for Campylobacter spp. at the slaughter age and therefore constitute the most important reservoir of the pathogen in nature. According to recommendations of the international health organizations (WHO, EFSA and CDC), but also from the results of various statistical and epidemiological models, the control of Campylobacter spp. in the production chain of broilers, and in particular during primary production, is expected to reduce significantly the bacterial counts in the carcasses and thus the likelihood of human infection. It is estimated that a 1 log10 reduction of the Campylobacter spp. counts in the ceca of broilers could reduce the risk of human infection up to 48%. Recently, EFSA, based on data from epidemiological studies, concluded that the addition of organic acids or biocidal blends, based on hydrogen peroxide or chlorine, in drinking the water could reduce the prevalence of Campylobacter spp. positive broiler flocks by 55%. Currently, several commercially available products-blends of acids are used in poultry farms to maintain the hygiene of the drinking water or for growth enhancement. However, the anti-Campylobacter activity of these commercial acidic blends remains unknown. In addition, the role of these products in the control of zoonotic pathogens, such as C. jejuni, still needs to be elucidated. Finally, the urgent need for the development of innovative methods to control the prevalence of Campylobacter spp. in broilers, as well as the frequent use of the commercial blends of acids in the drinking water of commercial livestock, were the motivation for the present study and formed its main objectives. The first objective of the doctoral thesis was the in vitro investigation of the anti-Campylobacter activity of nine commercial products, which are approved by the EU for use in the drinking water of birds and consist of specific blends of organic and/or inorganic acids. In this study, a total of two C. jejuni strains and one C. coli strain were used. The evaluation of the antibacterial activity of the tested products was performed with the method of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), according to CLSI standards M07-A10 (CLSI, 2015) and M100-S28 (CLSI, 2018), with some modifications. The MIC is defined as the lowest concentration of a chemical that visually inhibits the growth of a particular microbe. Each product was tested in triplicate against each of the selected Campylobacter spp. strain. According to the results of this study, all the tested commercial products were able to inhibit the growth of the tested Campylobacter spp. strains at the dose proposed by their manufacturer. CID 2000™ and Aqua-clean® products demonstrated the most potent activity in this study against C. jejuni and C. coli (0.002%–0.004% v/v). Based on the results of the in vitro study, the current legislative framework, the frequency of use in poultry farming, and the lack of references in the international literature regarding the product's action on the control of C. jejuni in broilers, the commercial blend of acids selected for the in vivo study was CID 2000™.The second objective of the doctoral thesis was the in vivo investigation of the effect of CID 2000™ on controlling C. jejuni in experimentally challenged broiler chicks. Additionally, through the in vivo study, the impact of CID 2000™ on the health and welfare of broilers was assessed for the first time. The experimental design included the random allocation of one hundred and twenty-eight 1-day old broilers chicks (Ross 308®) in 4 experimental groups of 32 birds. Each group consisted of 4 subgroups-replicates of 8 birds. Specifically, the experimental groups were as follows: Group A: the negative control (chicks were not challenged and received only tap water), Group B: birds were challenged by C. jejuni and received tap water treated by 0.01-0.05 % v/v CID 2000™; Group C: birds were challenged by C. jejuni and received tap water without treatment; Group D: birds were challenged by C. jejuni and received tap water treated by 0.01-0.05 % v/v CID 2000™. The duration of the experiment was 36 days and the birds infected by oral ingestion of 106 CFU C. jejuni on the 18th day of life. During the trial, birds were examined daily for clinical signs. On the 7th, 13th, 18th, 20th, 23rd and 36th day of the experiment, a calibration assessment of the incidence rate and the degree of intensity of diarrheal feces was carried out, through the assessment of plumage besmirchment in the area around the cloaca. Additionally, the birds' BW was measured on the 1st, 7th, 13th, 18th, 23rd and 36th day, while the ADFI, the FCR and the ADWI were calculated for the intervals of the 1st-13th, 14th- 23rd, 24th-36th and 1st- 36th day. Finally, the EPEF was calculated for the total period of experimentation (1st- 36th day). During the experiment 2 samplings were performed, on day 23 (5 days post-infection) and day 36 (18 days post-infection). The tests carried out were: a) enumeration of C. jejuni in the crop and ceca, b) isolation of C. jejuni from the liver, c) histomorphometric and histopathological evaluation of tissue samples from the duodenum, jejunum and ileum, d) histopathological investigation of liver tissue samples, e) macroscopic assessment of lesions in the footpads, in the gizzard, liver and intestines g) measurement of the pH value of the contents in the crop, duodenum, jejunum, ileum and ceca, and h) measuring the viscosity of the contents of the jejunum and the ileum of birds. According to the results of the in vivo study, the infection of broilers with the C. jejuni KC40 strain resulted in significantly high counts of the microorganism in the ceca of birds. The challenge also increased significantly the occurrence and severity of diarrheic feces, induced adverse alterations on intestinal histomorphology, and led to a high isolation rate of the microorganism from the liver of the infected birds. The sanitation of the drinking water, by CID 2000™ significantly reduced the counts of C. jejuni in the ceca of broilers (5 days after infection), reduced the occurrence and severity of diarrheic feces, ameliorated the histomorphometric changes caused by C. jejuni in the intestine, and significantly reduced the isolation rate of the microorganism from the liver of the challenged birds. However, CID 2000™ did not reduce the transmission rate of C. jejuni among broiler chicks, with the protocol applied in this study.

Η μόλυνση του ανθρώπου με βακτήρια του γένους Campylobacter αποτελεί την κύρια αιτία βακτηριακής τροφιμογενούς γαστρεντερίτιδας παγκοσμίως, με την καμπυλοβακτηρίωση να είναι η συχνότερη ζωονόσος που καταγράφεται στην Ευρωπαϊκή Ένωση, με πάνω από 220.000 κρούσματα για το 2019. Το κρέας πουλερικών και κυρίως αυτό των κρεοπαραγωγών ορνιθίων, αποτελεί την κύρια πηγή μόλυνσης του ανθρώπου και το Campylobacter jejuni (C. jejuni) είναι το είδος που εμπλέκεται στη πλειονότητα των περιστατικών. Υπολογίζεται ότι το 60-80% των εμπορικών σμηνών κρεοπαραγωγών ορνιθίων, είναι θετικά στο Campylobacter spp. σε ηλικία σφαγής και ως εκ τούτου, αποτελούν την πιο σημαντική δεξαμενή του μικροοργανισμού στη φύση. Σύμφωνα με τις εκτιμήσεις των Διεθνών Οργανισμών Υγείας (ΠΟΥ, EFSA και CDC), αλλά και από τα αποτελέσματα στατιστικών και επιδημιολογικών μοντέλων, ο έλεγχος του Campylobacter spp. στην αλυσίδα παραγωγής κρεοπαραγωγών ορνιθίων και ειδικότερα κατά τη διάρκεια της πρωτογενούς παραγωγής, αναμένεται να μειώσει σημαντικά τους πληθυσμούς Campylobacter spp. στα τελικά σφάγια και κατ’ επέκταση την πιθανότητα μόλυνσης του ανθρώπου. Πρόσφατα, η EFSA βασιζόμενη σε επιδημιολογική ανάλυση για τον πληθυσμό, κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η προσθήκη οργανικών οξέων ή βιοκτόνων συνδυασμών οξέων με βάση το χλώριο ή το υπεροξείδιο του υδρογόνου στο πόσιμο νερό των πτηνών, θα μπορούσε να μειώσει τον επιπολασμό του Campylobacter spp. στις εκτροφές κρεοπαραγωγών ορνιθίων κατά 55%. Υπάρχουν αρκετά εμπορικά διαθέσιμα προϊόντα που περιέχουν συγκεκριμένους συνδυασμούς οργανικών ανόργανων οξέων, τα οποία χρησιμοποιούνται στην εξυγίανση του πόσιμου νερού των εκτρεφόμενων πτηνών. Ωστόσο, η δράση αυτών των εμπορικών μιγμάτων οξέων κατά του Campylobacter παραμένει άγνωστη, ενώ ελάχιστα δεδομένα είναι γνωστά σε σχέση με τη δυνατότητα των μικροοργανισμών να αναπτύσσουν ανθεκτικότητα σε αυτά τα προϊόντα. Μέχρι στιγμής, καμία μέθοδος ελέγχου του μικροοργανισμού σε επίπεδο εκτροφής δεν έχει αποδειχθεί πλήρως αποτελεσματική και ταυτόχρονα οικονομικά βιώσιμη για τον έλεγχο του Campylobacter spp. στα κρεοπαραγωγά ορνίθια. Η επιτακτική ανάγκη για την ανάπτυξη καινοτόμων μεθόδων ελέγχου του επιπολασμού του Campylobacter spp. στα εμπορικά σμήνη πτηνών, καθώς και η συχνή χρήση των εμπορικών προϊόντων-μιγμάτων οξέων στο πόσιμο νερό των εκτροφών, αποτέλεσαν το κίνητρο για την παρούσα μελέτη και διαμόρφωσαν τους βασικούς της στόχους. Ο πρώτος στόχος της διδακτορικής διατριβής αφορούσε την in vitro αξιολόγηση της αντί-Campylobacter δράσης εννέα (9) εμπορικών προϊόντων, τα οποία έχουν εγκριθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση για χρήση στο πόσιμο νερό των ορνιθίων, και περιέχουν συγκεκριμένους συνδυασμούς οργανικών ή/και ανόργανων οξέων. Στη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν συνολικά δύο στελέχη C. jejuni και ένα στέλεχος C. coli. H εκτίμηση της δράσης των εμπορικών μιγμάτων οξέων έναντι των στελεχών έγινε με τη μέθοδο της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (Minimum Inhibitory Concentration – MIC) σύμφωνα με τα CLSI standards M07-A10 και M100-S28. Η MIC ορίζεται ως η μικρότερη συγκέντρωση μιας χημικής ουσίας η οποία αναστέλλει οπτικά την ανάπτυξη ενός συγκεκριμένου μικροβίου. Η εξέταση για κάθε σκεύασμα έγινε εις τριπλούν έναντι κάθε στελέχους Campylobacter. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της in vitro μελέτης, όλα τα εμπορικά προϊόντα που επιλέχθηκαν ήταν ικανά να αναστείλουν την ανάπτυξη των εξεταζόμενων στελεχών Campylobacter spp. Στη δόση που προτείνεται από τον παρασκευαστή. Δυο προϊόντα, το CID 2000™ και το Aqua-clean® κατέγραψαν την πιο ισχυρή δράση σε αυτή τη μελέτη, έναντι του C. jejuni και του C. coli (0,002%– 0.004%v/v). Με βάση τα αποτελέσματα της in vitro μελέτης, το ισχύον νομοθετικό πλαίσιο, τη συχνότητα χρήσης στη πτηνοτροφία και την απουσία αναφορών από τη διεθνή βιβλιογραφία σχετικά με τη δράση του προϊόντος στον επιπολασμό του C. jejuni στα κρεοπαραγωγά ορνίθια, το εμπορικό μίγμα οξέων που επιλέχθηκε για την in vivo μελέτη ήταν το CID 2000™. Ο δεύτερος στόχος της διδακτορικής διατριβής ήταν η in vivo αξιολόγηση της επίδρασης του CID 2000™ στον έλεγχο του επιπολασμού του C. Jejuni στα κρεοπαραγωγά ορνίθια. Επιπλέον, εκτιμήθηκε για πρώτη φορά η επίδραση της χορήγησης του CID 2000™ στην υγεία και την ευζωία των κρεοπαραγωγών ορνιθίων. Ο πειραματικός σχεδιασμός περιλάμβανε την τυχαία κατανομή 128 νεοσσών (Ross 308®), ηλικίας μιας ημέρας, σε τέσσερις (4) πειραματικές ομάδες των 32 ορνιθίων. Κάθε ομάδα, αποτελούνταν από τέσσερις (4) επιμέρους υποομάδες-επαναλήψεις των οκτώ (8) ορνιθίων. Η συνολική διάρκεια του πειραματισμού ήταν 36 ημέρες. Οι πειραματικοί χειρισμοί που διενεργήθηκαν ήταν η χορήγηση του μίγματος οξέων με το πόσιμο νερό και η μόλυνση των πτηνών με C. jejuni. Συγκεκριμένα, οι πειραματικές ομάδες ήταν οι εξής τέσσερις: 1) Ομάδα Α: τα ορνίθια της ομάδας χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες, 2) Ομάδα Β: στα ορνίθια της ομάδας χορηγήθηκε το εμπορικό μίγμα οξέων, 3) Ομάδα Γ: στα ορνίθια της ομάδας διενεργήθηκε μόλυνση με C. jejuni, 4) Ομάδα Δ: στα ορνίθια της ομάδας χορηγήθηκε το εμπορικό μίγμα οξέων και μολύνθηκαν με C. jejuni. Τα ορνίθια μολυνθήκαν τη 18η ημέρα της ζωής τους με 106 CFU C. jejuni. Η κλινική εικόνα των ορνιθίων ελεγχόταν καθημερινά. Την 7η, 13η, 18η, 20η, 23η και 36η ημέρα του πειραματισμού, διενεργήθηκε βαθμονομική εκτίμηση του ποσοστού εμφάνισης και του βαθμού έντασης διαρροϊκών κοπράνων, μέσω της εκτίμησης της παρουσίας ρυπαρού υλικού στο πτέρωμα της περιοχής της αμάρας. Κατά τη διάρκεια του πειραματισμού το ΣΒ των ορνιθίων εκτιμήθηκε την 1η, 7η, 13η, 18η, 23η και 36η ημέρα, ενώ η ΜΗΚΤ, ο ΔΜΤ και η ΜΗΚΝ υπολογίστηκαν για τα χρονικά διαστήματα από την 1η-13η, την 14η-23η, την 24η-36η και την 1η-36η ημέρα πειραματισμού. Τέλος, ο ΕΔΠ υπολογίστηκε για τη συνολική περίοδο του πειραματισμού (1η-36η ημέρα). Συνολικά, στον in vivo πειραματισμό πραγματοποιήθηκαν δύο (2) δειγματοληψίες, την 23η ημέρα (5 ημέρες μετά τη μόλυνση) και την 36η ημέρα (18 ημέρες μετά τη μόλυνση). Οι εξετάσεις που διενεργήθηκαν ήταν: α) η καταμέτρηση των C. jejuni στον πρόλοβο και τα τυφλά, β) η απομόνωση του C. jejuni από το ήπαρ, γ) η ιστομορφομετρική και ιστοπαθολογική εκτίμηση δειγμάτων από το δωδεκαδάκτυλο, τη νήστιδα και τον ειλεό, δ) η ιστοπαθολογική διερεύνηση δειγμάτων ήπατος, ε) η μακροσκοπική εκτίμηση των αλλοιώσεων στα πέλματα, στους ταρσούς, στον μυώδη στόμαχο, στο ήπαρ και το έντερο των ορνιθίων, ζ) η μέτρηση του pH του περιεχομένου στον πρόλοβο, στο δωδεκαδάκτυλο, στη νήστιδα, στον ειλεό και τα τυφλά, και η) η μέτρηση του ιξώδους του περιεχομένου στη νήστιδας και τον ειλεό των ορνιθίων. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της in vivo μελέτης, η μόλυνση των κρεοπαραγωγών ορνιθίων με το στέλεχος C. jejuni KC40 οδήγησε στην επιτυχή εγκατάσταση του μικροοργανισμού στο έντερο, σχηματίζοντας μεγάλο πληθυσμό στη περιοχή των τυφλών. Επιπλέον, η μόλυνση αύξησε σημαντικά τη συχνότητα εμφάνισης και τον βαθμό έντασης διαρροϊκών κοπράνων, επηρέασε αρνητικά την ιστομορφολογία του εντέρου και οδήγησε σε υψηλό ποσοστό απομόνωσης του μικροοργανισμού από το ήπαρ των ορνιθίων. Η χορήγηση του CID 2000™ μείωσε σημαντικά τον πληθυσμό του C. jejuni στα τυφλά των ορνιθίων (5 ημέρες μετά τη μόλυνση), περιόρισε τη συχνότητα εμφάνισης και το βαθμό έντασης διαρροϊκών κοπράνων, βελτίωσε τις ιστομορφομετρικές μεταβολές που προκάλεσε το C. jejuni στο έντερο και περιόρισε σε σημαντικό βαθμό το ποσοστό απομόνωσης του μικροοργανισμού από το ήπαρ των μολυσμένων ορνιθίων, χωρίς ωστόσο να περιορίσει τη μετάδοση του C. jejuni μεταξύ των ορνιθίων.