Διατροφικές προκλήσεις και μικροβίωμα πεπτικού συστήματος σε εκτρεφόμενους υδρόβιους οργανισμούς

Abstract

During the last decade, the rapid advancement in next-generation sequencing technologies has facilitated the structural and functional characterization of microbial communities, revealing a multitude of microorganisms that colonize the intestinal lumen in an endosymbiotic regime. The multifaceted contribution of gut microbiota to the proper functioning of the host-organism has attracted interest in a variety of animal organisms, with the majority of research focusing on the responsive modulation under environmental and/or dietary influence. In the context of intensifying and establishing a sustainable aquaculture industry, driven by a seafood production with mitigated ecological footprint, alternative to fishmeal protein sources in aquafeed are urgently needed. Therefore, the present thesis aims to clarify the impact of partial fishmeal substitution with insect-based meals (Tenebrio molitor, Hermetia illucens and Musca domestica) on the gut microbial ecology of three aquatic animal species, gilthead seabream (Sparus aurata) and European seabass (Dicentrarchus labrax), as well as the Baltic shrimp (Palaemon adspersus), a potential decapod crustacean candidate for the Greek aquaculture. Bacterial assessment in mesenteric samples was implemented by recruiting Illumina MiSeq sequencing technology, targeting the V3-V4 region of the 16S rRNA gene. Prior to the gut microbiota investigation, the present thesis focused on the determination of a sample size sufficient to yield statistically reliable representative population-level inferences in metabarcoding analysis of microbial communities in reared fish species. In this regard, sequencing results from 12 individuals per diet were randomized in all possible combinations of n-1 individuals and the probability of recording the mean abundance and diversity parameters was subsequently calculated. The present findings indicated that increasing sample size limits the dominance of individuals with high microbial load in the results and additionally provides the required statistical confidence for reliable estimations of diet-induced shifts in gut microbial communities. Furthermore, the results suggest that the primary aim of the study should drive the sample size selection, since three samples were proven herein sufficient for partial mean diversity estimation, whereas nine samples were deemed necessary to determine true species richness and detect changes in response to nutritional challenges. Partial fishmeal substitution with insect meals maintained the predominance of Firmicutes, Proteobacteria and Actinobacteria as the main bacterial phyla in the gut microbiota of the two fish species without significant changes in diversity indices. However, species-specific shifts were observed in response to the diets, with the microbial communities of S. aurata showcasing more prominent differentiation and inter-individual variability between dietary groups. Insect meals favored niche shaping within the communities, which contributed to the emergence and/or dominance of several beneficial bacteria, including lactic acid bacteria widely used in aquaculture as probiotics. Moreover, co-occurrence network analysis revealed a plethora of unique insect meal-induced bacterial interactions, crucial in defining the functionality and ecological stability of microbial communities. The predicted functional profile of gut microbiota showed significant differences in bacterial genes associated with miscellaneous processes, including metabolic pathways. In addition, the dietary-induced modulations of microbial communities seem to exert tissue-specific effects on basal intermediary metabolism, as indicated by the estimated enzymatic activity. In regard to P. adspersus, the preliminary assessment showcased the prevalence of Proteobacteria in the microbial communities, while enrichment of Firmicutes was apparent following partial substitution with insect meals potentially due to the presence of chitin as well as changes in the carbohydrate source. Among the examined insect meals, H. illucens putatively promoted microbial balance and favored physiological status indicators such as the Firmicutes to Bacteroidetes ratio, indirectly contributing to the improvement of P. adspersus growth. On the contrary, the results regarding T. molitor as a fishmeal substitute indicated alterations in the diversity and the evenness of microbial ecosystems, which may provoked gut dysbiosis and favored the emergence of opportunistic pathogenic and non-pathogenic bacteria. Conclusively, the present doctoral thesis provides critical findings relevant to the experimental design of future metabarcoding research in farmed fish species and underlines the significance in selecting a sufficient sample size to reliably imprint and elucidate the dietary effects on gut microbial communities. Furthermore, the present findings emphasize the impact of diet on the configuration and equilibrium of microbial communities and demonstrate that insect meals as feed ingredients may trigger species-specific modifications of the structural and functional dynamics of gut microbial communities.

Κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας, η ραγδαία βελτίωση των τεχνολογιών αλληλούχισης νέας γενιάς έχει διευκολύνει το δομικό και λειτουργικό χαρακτηρισμό των μικροβιοκοινότητων υπό το πρίσμα περιβαλλοντικών και/ή διατροφικών επιδράσεων, αποκαλύπτοντας ένα πλήθος μικροοργανισμών που αποικίζουν τον εντερικό αυλό σε ένα καθεστώς ενδοσυμβίωσης. Στα πλαίσια της ανάπτυξης και εδραίωσης μιας βιώσιμης βιομηχανίας υδατοκαλλιεργειών, όπου επικρατεί η παραγωγή θαλασσινών προϊόντων με μειωμένο οικολογικό αποτύπωμα, επιτάσσεται η εύρεση εναλλακτικών πηγών πρωτεϊνών για τις ιχθυοτροφές. Ως εκ τούτου, η παρούσα διατριβή αποσκοπεί στην αποσαφήνιση του αντίκτυπου της μερικής υποκατάστασης του ιχθυάλευρου με άλευρα από προνύμφες εντόμων (Tenebrio molitor, Hermetia illucens και Musca domestica) στην μικροβιακή οικολογία του εντέρου τριών ειδών υδρόβιων ζωικών οργανισμών, της τσιπούρας (Sparus aurata) και του λαβρακιού (Dicentrarchus labrax), καθώς και ενός δυνητικά εκτρεφόμενου δεκάποδου καρκινοειδούς, της γαρίδας της Βαλτικής (Palaemon adspersus). Η βακτηριακή εκτίμηση στο DNA των μεσεντερικών δειγμάτων υλοποιήθηκε επιστρατεύοντας την τεχνολογία Illumina MiSeq για την αλληλούχιση της περιοχής V3-V4 του γονιδίου 16S rRNA.Προτού πραγματοποιηθεί η μελέτη των μικροβιακών κοινοτήτων, η παρούσα διατριβή εστίασε στον καθορισμό του δειγματοληπτικού μεγέθους που είναι επαρκές να αποδώσει με στατιστική ασφάλεια αντιπροσωπευτικά συμπεράσματα για το σύνολο του πληθυσμού σε μεταγονιδιωματικές αναλύσεις μικροβιοκοινοτήτων εκτρεφόμενων ιχθύων. Για το σκοπό αυτό, τα αποτελέσματα της αλληλούχισης από 12 άτομα ανά διατροφική ομάδα τυχαιοποιήθηκαν σε όλους τους πιθανούς συνδυασμούς n-1 ατόμων και ακολούθως υπολογίστηκε η πιθανότητα καταγραφής των μέσων παραμέτρων αφθονίας και ποικιλότητας. Τα ευρήματα της παρούσας διατριβής ανέδειξαν ότι η αύξηση του μεγέθους δείγματος μπορεί να περιορίσει την επικράτηση ατόμων με υψηλό μικροβιακό φορτίο στα αποτελέσματα και να εξασφαλίσει τη στατιστική εμπιστοσύνη που απαιτείται για την αξιόπιστη εκτίμηση των διατροφικά επαγόμενων μετατοπίσεων στις μικροβιοκοινότητες του εντέρου. Περαιτέρω, τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η επιλογή του δειγματοληπτικού μεγέθους οφείλει να συνάδει με τον πρωταρχικό σκοπό της έρευνας, δεδομένου ότι τρία δείγματα καθίστανται επαρκή για τη μερική εκτίμηση της μέσης ποικιλότητας, ενώ αντίθετα για τον προσδιορισμό του πραγματικού πλούτου ειδών και την καταγραφή μεταβολών ως απόκριση σε διατροφικές προκλήσεις απαιτείται αριθμός δειγμάτων που ανέρχεται στα εννέα. Η μερική υποκατάσταση με εντομοάλευρα διατήρησε την επικράτηση των Firmicutes, Proteobacteria και Actinobacteria ως τα κυρίαρχα βακτηριακά φύλα στις μικροβιακές κοινότητες των δύο ειδών ιχθύων χωρίς σημαντικές μεταβολές στους δείκτες ποικιλότητας. Εντούτοις, τα δύο είδη υπέδειξαν ειδο-ειδική απόκριση στις ιχθυοτροφές, με τις μικροβιακές κοινότητες του S. aurata να παρουσιάζουν μεγαλύτερη διαφοροποίηση και δια-ατομική διακύμανση μεταξύ των διατροφικών ομάδων. Τα εντομοάλευρα ευνόησαν τη δημιουργία οικοθέσεων στις κοινότητες για εμφάνιση ή και κυριαρχία διάφορων ωφέλιμων βακτηρίων, συμπεριλαμβανομένων βακτηρίων του γαλακτικού οξέος που χρησιμοποιούνται ευρέως στις υδατοκαλλιέργειες ως προβιοτικά. Η ανάλυση δικτύων συνύπαρξης ανέδειξε πληθώρα μοναδικών βακτηριακών αλληλεπιδράσεων που ευνοούνται από τα εντομοάλευρα και συμβάλλουν στον καθορισμό της λειτουργικότητας και στην οικολογική σταθερότητα των μικροβιοκοινοτήτων. Επιπρόσθετα, το προβλεπόμενο λειτουργικό προφίλ των εντερικών κοινοτήτων υπέδειξε σημαντικές διαφοροποιήσεις σε γονίδια που σχετίζονται με ποικίλες λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένων των μεταβολικών μονοπατιών. Οι επαγόμενες από τα εντομοάλευρα αλλαγές στις μικροβιακές κοινότητες ενδέχεται να επηρέασαν ιστο-ειδικά το βασικό ενδιάμεσο μεταβολισμό, όπως παρατηρήθηκε σύμφωνα με την ενζυμική δραστικότητα. Όσον αφορά το P. adspersus, η προκαταρκτική εκτίμηση υπέδειξε την επικράτηση του φύλου Proteobacteria στις μικροβιακές κοινότητες, ενώ η μερική υποκατάσταση με τα εντομοάλευρα συνέβαλε στον εμπλουτισμό των Firmicutes ενδεχομένως λόγω της παρουσίας της χιτίνης και επιπρόσθετων αλλαγών στην πηγή των υδατανθράκων. Ανάμεσα στα υπό μελέτη εντομοάλευρα, η μερική υποκατάσταση με H. illucens πιθανώς προώθησε τη μικροβιακή ισορροπία και ευνόησε δείκτες της φυσιολογικής κατάστασης όπως ο λόγος Firmicutes προς Bacteroidetes, συμβάλλοντας έμμεσα στη βελτίωση της αύξησης του P. adspersus. Εν αντιθέσει, τα αποτελέσματα σχετικά με το T. molitor ως υποκατάστατο του ιχθυαλεύρου υπέδειξαν διαταραχές στην ποικιλότητα και ομοιομορφία των μικροβιακών οικοσυστημάτων, ευνοώντας την ανάπτυξη εντερικής δυσβίωσης και την εμφάνιση ευκαιριακών παθογόνων και μη βακτηρίων.Εν κατακλείδι, η παρούσα διατριβή παραθέτει σημαντικά ευρήματα για τον πειραματικό σχεδιασμό μελλοντικών μεταγονιδιωματικών μελετών σε εκτρεφόμενους ιχθείς και επισημαίνει την επιτακτική ανάγκη επιλογής επαρκούς δειγματοληπτικού μεγέθους, ικανού να αποτυπώσει με αξιοπιστία τις διατροφικές επιδράσεις στις εντερικές μικροβιακές κοινότητες. Περαιτέρω, τα παρόντα ευρήματα υπογραμμίζουν τη συμβολή της διατροφής στη διαμόρφωση και ισορροπία των μικροβιοκοινοτήτων και υποδεικνύουν ότι η χρήση των αλεύρων από διάφορα έντομα ως συστατικά των ζωοτροφών δύναται να προκαλούν ειδικές για το εκάστοτε είδος διαφοροποιήσεις της δομικής και λειτουργικής δυναμικής των μικροβιακών κοινοτήτων του εντέρου.