Ραδιοεπισημασμένοι αναστολείς κινάσης τυροσίνης για την ανάπτυξη μορίων με φαρμακολογικό ενδιαφέρον

Abstract

In this PhD thesis, novel complexes of technetium - 99m and rhenium, copper - 64, fluorine - 18, gallium - 68 and lanthanum - 133 bearing 4-anilinoquinazoline derivatives were designed, synthesized, and evaluated targeting to the development of target specific radiopharmaceuticals for both diagnostic and therapeutic approach of positive EGFR tumors. Firstly, a series of suitable monodentate quinazoline ligands bearing the isocyanide group was synthesized. For rhenium and technetium – 99m complexes at oxidation state (III), the tetradentate ligand NS3 was used, while for complexes at oxidation state I, they were used three different dithiocarbamide derivatives as bidentate ligands and the chelating agents PAMA, cysteine and a triazole analogue of histidine, attached to the pharmacophore, via a 6-carbon or 4-C carbon chain and a triazole ring, as the tridentate ligands. The complexation with 64Cu, 18F, 68Ga and 133La was accomplished using three chelating systems coupled to the quinazoline ring through aliphatic chains and triazole rings. The chelators chosen were NODAGA (for 64Cu), the alkyne analogue of RESCA (for 18F and 68Ga) and the alkyne analogue of macropa (for 133La). The two developed quinazoline derivatives of RESCA and macropa differ, apart from their chelators, also in the number of carbon atoms connecting the chelators to the 4-anilinoquinazoline pharmacophore. The final ligands were synthesized in good yields and characterized by IR, NMR and MS.Rhenium complexes (III) and (I) were prepared in good yields using the precursor complexes [ReNS3(PMe2Ph)] and [NEt4]2[Re(CO)3Br3], resp., and characterized by IR and NMR. The [4+1] complexes of 99mTc were prepared by first synthesizing the [99mTc]TcEDTA complex and then adding the tetradentate NS3 and the respective quinazoline isocyanide. The 99mTc (I) complexes were formed up to 98 % radiochemical purity in a one-step reaction from the precursor complex [99mTc] fac-[Tc(CO)3(H2O)3]+. The characterization of 99mTc complexes was performed by comparative HPLC analysis using the characterized analogous Re complexes, as reference. Radiolabeling of NODAGA – quinazoline ligand with 64Cu gave the desired complex with RY and RCP of 100 % when they were applied ligand’s concentrations from 10-3 to 10-5 M. During 18F radiolabelings, the[18F][AlF] method was used, as the RESCA chelator bearing the quinazoline substituent was coordinated to the aluminum via the two N atoms and the three O atoms of the carboxylic acids. The negatively charged complexes were formed in ~98 % yield when the reaction was heated at 95 ⁰C for half an hour. The same coordination was found during the 68Ga complexation, where the radiolabeling of the two RESCA – quinazoline ligands was studied at six different concentrations at 40 ⁰C for 15 minutes. On the contrary, the 133La – macropa quinazoline complexes were prepared at room temperature in high radiochemical yields and purities up to 100 %, when ligands’ concentrations of 10-3 – 10-5M were used. All radioactive complexes showed high stability even during incubation with antagonists, like cysteine and histidine, or in human blood serum. The determination of logD in octanol / PBS pH 7.4 system showed that the complexes of 99mTc were lipophilic while the radio-complexes of 64Cu, 18F, 68Ga and 133La were hydrophilic with negative logD values. The cytotoxicity of the ligands and their Re complexes was assessed by the MTT method. The results showed that the derivatives were toxic against A431 cell growth with IC50 values comparable to analogue complexes in the literature. Determination of the inhibition of EGFR phosphorylation showed that the new Re complexes, 25b and 29, inhibited the phosphorylation of the receptor with IC50 values significantly lower than the already reported one in the literature. Among the NODAGA-, RESCA- and macropa- quinazoline derivatives, the ligand bearing the NODAGA showed higher cytotoxic activity against A431 and FaDu cancer cell lines. Cellular uptake studies in A431, FaDu and MDA – MB 435S cells for the radioactive complexes of 64Cu, 18F, 68Ga and 133La showed that the highest uptake appeared in A431 cells and also, the positively charged complexes of 133La had the highest cellular uptake. To investigate further the binding to the EGFR, immunoprecipitation experiments were performed. The results showed that the negatively charged complex of 64Cu appeared to specifically bind to the EGFR. Biodistribution studies of 99mTc complexes in healthy and tumor-bearing mice showed rapid blood clearance, hepatobiliary excretion, and tumor uptake.

Στην παρούσα διατριβή σχεδιάστηκαν, συντέθηκαν και αξιολογήθηκαν νέα σύμπλοκα του τεχνητίου – 99m και του ρηνίου, του χαλκού – 64, του φθορίου – 18, του γαλλίου – 68 και του λανθανίου – 133 που φέρουν παράγωγα της 4-ανιλινοκιναζολίνης με στόχο την ανάπτυξη ραδιοφαρμάκων για την διάγνωση και θεραπεία καρκινικών όγκων που υπερεκφράζουν τον EGFR. Αρχικά, συντέθηκαν μια σειρά κατάλληλων κιναζολινικών υποκαταστατών που φέρουν την ομάδα του ισοκυανιδίου αποτελώντας τους μονοδραστικούς υποκαταστάτες. Για την ανάπτυξη των συμπλόκων του ρηνίου και του τεχνητίου στην οξειδωτική βαθμίδα ΙΙΙ χρησιμοποιήθηκε ως τετραδαστικός υποκαταστάτης ο NS3, ενώ για τα σύμπλοκα της οξειδωτικής βαθμίδας Ι και την σταθεροποίηση του τρικαρβόνυλο πυρήνα χρησιμοποιήθηκαν τρία διαφορετικά διθειοκαρβαμίδικά παράγωγα και οι χηλικοί υποκαταστάτες PAMA, κυστεΐνη και τριαζολικό ανάλογο της ιστιδίνης που συνδέθηκαν με τη φαρμακοφόρο δομή μέσω μιας ανθρακικής αλυσίδας 6 ατόμων ή 4 ατόμων C και ένα δακτύλιο τριαζολίου. Η συναρμογή των 64Cu, 18F, 68Ga και 133La πραγματοποιήθηκε με την επιλογή τριών χηλικών συστημάτων που συζεύχθηκαν με τον κιναζολινικό δακτύλιο μέσω αλειφατικών αλυσίδων και τριαζολικών δακτυλίων. Τα χηλικά που επιλέχθηκαν ήταν το NODAGA (για το 64Cu), το αλκινικό ανάλογο του RESCA (για το 18F και το 68Ga) και το αλκινικό ανάλογο του macropa (για το 133La). Τα κιναζολινικά παράγωγα του RESCA και του macropa είναι τέσσερα και εκτός από το χηλικό που φέρουν διαφέρουν και ανά δύο στον αριθμό ατόμων ανθράκων που συνδέουν τα χηλικά με το φαρμακοφόρο της 4-ανιλινοκιναζολίνης. Οι τελικοί υποκαταστάτες συντέθηκαν σε ικανοποιητικές αποδόσεις και χαρακτηρίστηκαν με IR, NMR και MS. Τα σύμπλοκα του ρηνίου (ΙΙΙ) και (Ι) παρασκευάστηκαν σε καλές αποδόσεις χρησιμοποιώντας τα πρόδρομα σύμπλοκα [ReNS3(PMe2Ph)] και [NEt4]2[Re(CO)3Br3], αντιστοίχως, και χαρακτηρίστηκαν με IR και NMR. Η μεταφορά των πειραμάτων σε επίπεδο ιχνηθετών έδωσε τα ραδιενεργά ανάλογα σε υψηλές αποδόσεις και καθαρότητα. Τα [4+1] σύμπλοκα του 99mTc παρασκευάστηκαν, αφού συντέθηκε πρώτα το σύμπλοκο του [99mTc]TcEDTA και ύστερα προστέθηκαν ο τετραδραστικός NS3 και το εκάστοτε κιναζολινικό ισοκυανίδιο. Τα σύμπλοκα του 99mTc (Ι) σχηματίστηκαν με καθαρότητα έως και 98 % σε αντίδραση ενός σταδίου από το πρόδρομο σύμπλοκο [99mTc] fac-[Tc(CO)3(H2O)3]+. Η ταυτοποιήση των 99mTc συμπλόκων πραγματοποιήθηκε με συγκριτική χρωματογραφία HPLC χρησιμοποιώντας τα χαρακτηρισμένα ανάλογα σύμπλοκα του Re, ως αναφορά. Η επισήμανση του NODAGA – κιναζολινικού υποκαταστάτη με το 64Cu έδωσε το επιθυμητό σύμπλοκο με RY και RCP 100 % όταν χρησιμοποιήθηκαν συγκεντρώσεις υποκαταστάτη από 10-3 έως 10-5 Μ. Για την επισήμανση με 18F έγινε χρήση της τεχνικής του [18F][AlF], καθώς το χηλικό RESCA που φέρει ο κιναζολινικός υποκαταστάτης συναρμόζεται με το αργίλιο μέσω των δύο ατόμων Ν και των τριών ατόμων Ο του καρβοξυλικού οξέος. Τα αρνητικά φορτισμένα σύμπλοκα σχηματίστηκαν με απόδοση ~ 98 %, όταν η αντίδραση θερμάνθηκε στους 95 ⁰C για μισή ώρα. Το ίδιο είδος συναρμογής συναντάται και κατά την συμπλοκοποίηση του 68Ga, όπου η επισήμασνη των δύο RESCA – κιναζολινικών υποκαταστατών μελετήθηκε σε έξι διαφορετικές συγκεντρώσεις στους 40 ⁰C για 15 λεπτά. Αντιθέτως, τα σύμπλοκα των 133La – macropa κιναζολινικών υποκαταστατών παρασκευάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου σε υψηλές αποδόσεις και καθαρότητες έως και 100 %, όταν χρησιμοποιήθηκαν συγκεντρώσεις υποκαταστατών 10-3 – 10-5Μ. Όλα τα ραδιενεργά σύμπλοκα παρουσίασαν υψηλή σταθερότητα σε μελέτες που περιλάμβαναν επώαση με ανταγωνιστές, όπως κυστεΐνη και ιστιδίνη, ή σε ανθρώπινο ορό αίματος. Ο προσδιορισμός του logD σε σύστημα οκτανόλης / PBS pH 7.4 έδειξε πως τα σύμπλοκα του 99mTc είναι λιπόφιλα ενώ τα ραδιο – σύμπλοκα των 64Cu, 18F, 68Ga και 133La είναι υδρόφιλα με αρνητικές τιμές logD.Στη συνέχεια αξιολογήθηκε η κυτταροτοξικότητα των υποκαταστατών και των σμπλόκων τους με το ρήνιο με τη μέθοδο MTT. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως τα παράγωγα είναι δραστικά έναντι της κυτταρικής αύξησης με τιμές IC50 συγκρίσιμες με ανάλογα σύμπλοκα της βιβλιογραφίας. Ο προσδιορισμός της αναστολής της φωσφορυλίωσης του EGFR παρουσίασε πως τα νέα σύμπλοκα του Re, 25b και 29, αναστέλλουν τη φωσφορυλίωση του υποδοχέα με τιμές IC50 σημαντικά χαμηλότερες από ότι αναφέρεται στη βιβλιογραφία για ανάλογο σύμπλοκο. Μεταξύ των κιναζολινικών παραγώγων του NODAGA, RESCA και macropa, ο υποκαταστάτης που φέρει το NODAGA εμφάνισε αυξημένη κυτταροτοξική δράση έναντι των καρκινικών σειρών A431 και FaDu. Οι μελέτες κυτταρικής πρόσληψης σε κύτταρα A431, FaDu και MDA – MB 435S για τα ραδιενεργά σύμπλοκα των 64Cu, 18F, 68Ga και 133La έδειξαν πως γενικά η μεγαλύτερη πρόσληψη φαίνεται να υπάρχει στα Α431 κύτταρα. Επίσης, τα θετικά φορτισμένα σύμπλοκα του 133La εμφάνισαν τη μεγαλύτερη πρόσληψη στα κύτταρα. Η περαιτέρω αξιολόγηση του τρόπου δέσμευσης των συμπλόκων με τον EGFR οδήγησαν στην πραγματοποίηση πειραμάτων ανοσοκατακρίμνησης όπου το αρνητικά φορτισμένο σύμπλοκο του 64Cu φαίνεται να εμφανίζει ειδικό τρόπο δέσμευσης με τον υποδοχέα. Οι βιοκατανομές των συμπλόκων του 99mTc σε υγιή ποντικούς και σε ποντίκια που φέρουν όγκο παρουσίασαν γρήγορη αιματική κάθαρση, απέκκριση από το ηπατοχολικό σύστημα και παρατηρήθηκε πρόσληψη στον όγκο.