Συσχέτιση της γενετικής ποικιλότητας του Col17A1 με την εκδήλωση πομφολυγώδους πεμφιγοειδούς σε ασθενείς με νευρολογικές παθήσεις

Abstract

Bullous pemphigoid (BP) is an autoimmune disease of the skin, characterized by the presence of subepidermal bullae, with higher predominance in the elderly. It is caused by autoantibodies against the structural components of the hemidesmosomes of the basal membrane, compromising the dermal-epidermal cohesion. Correlation between BP and neurodegenerative disorders has been reported in multiple studies. The most common neurological diseases that have been correlated to this day include dementia, multiple sclerosis, stroke, Parkinson’s disease and Alzheimer’s disease. Both the epidermis and the central nervous system have common embryologic origin from the ectoderm. Common laboratory finding among the patients suffering from both diseases is the presence of autoantibodies in the serum, mostly against the protein BP 180 (Col17). Protein BP 180 is encoded by the gene COL17A1 within the chromosome 10 (10q25.1) and its main role is as structural material of the hemidesmosomes. It can also be found as structural material within the central nervous system, as well as in other types of tissue, in which its role remains unknown. The purpose of this dissertation is the investigation of the possible correlation between the genetic variation of the gene COL17A1 with the development of bullous pemphigoid in patients with neurological disorders. The study aims to examine the hypothesis that the protein Col17 (BP 180) acts as common antigen which stimulates an immune response against the skin and the central nervous system. Genetic variation can affect the expression of the protein, and in the case of amino-acid substitution, the ability of the MHC molecules to present collagen XVII to the immune system, as well as the ability of the peripheral autoantibodies to connect with the molecule. Regarding gene COL17A1, 19 variants (SNVs) have been identified, from which only 3 result in changes within coding regions involving amino-acid substitution (rs805708, rs805722 and rs17116350). In this study, these 3 variants were genotyped in 4 groups of patients: 1. Patients with BP and neurological disorders (BPN – 61 patients), 2. Patient with BP (BP – 57 patients), 3. Patient with neurological diseases (N – 53 patients), 4. Controls (C – 60 patients). Molecular techniques were used to detect the genetic variation. Blood samples were collected from all the participants, after consent was given. From each sample, genomic DNA was isolated. Using PCR technique, the 3 segments of the gene COL17A1 containing the exons of interest were multiplied. For each exon, a specific restriction endonuclease was used in order for the sequence at the site of the variant to be identified. Statistical analysis of the results wasn’t able to reveal statistically safe conclusions regarding the hypothesis of the correlation between genetic variation of the gene COL17A1 and the development of BP in patient with neurological disorders. Most comparisons were not statistically significant. A few statistically significant correlations emerged, which could not be evaluated on their own, due to the Hardy-Weinberg disequilibrium of the control group regarding variant rs805722, as well as the predominance of this variant in the studied population. A significant finding was the predominance of the variant rs805722 of the exon 27 in the studied population. This predominance had a negative impact on the statistical analysis, leading to possible statistical bias. An equally remarkable result was the increased incidence of neurological disorders, by 1.6 times, in patients presenting the variant rs805708 in exon 10. In the main group study (BPN), 10 patients were identified with negative ELISA test for BP 180 and BP 230 autoantibodies. The serum of these patients, who were excluded from the group, was tested with immunoblotting (Western Blot) for the presence of new epitopes. Autoantibodies against numerous proteins, of different molecular weights, were found in the serum of the patients, which could not be identified though. To this day, it is not clear whether one disease precedes the other, or whether both are the result of other pathogenetic pathways and causes. Further investigation is required in order for the immunologic link between neurodegenerative disorders and bullous pemphigoid to be identified.

Το Πομφολυγώδες Πεμφιγοειδές (ΠΠ) είναι μια αυτοάνοση δερματική νόσος, που χαρακτηρίζεται από την παρουσία υποεπιδερμιδικών πομφολύγων (φυσαλίδων) και παρουσιάζει αυξημένη επίπτωση σε ηλικιωμένα άτομα. Προκαλείται από την παραγωγή αυτοαντισωμάτων έναντι συστατικών των ημιδεσμοσωματίων της βασικής μεμβράνης, διαταράσσοντας την συνοχή δέρματος – επιδερμίδας. Πολυάριθμες μελέτες αναφέρονται στην συσχέτιση μεταξύ του ΠΠ και νευροεκφυλιστικών νοσημάτων. Οι συχνότερες νευρολογικές παθήσεις που έχουν συσχετιστεί με το ΠΠ μέχρι σήμερα, είναι η άνοια, η πολλαπλή σκλήρυνση, τα ισχαιμικά αγγειακά εγκεφαλικά επεισόδια, η νόσος του Parkinson και η νόσος Alzheimer. Η επιδερμίδα, καθώς και το κεντρικό νευρικό σύστημα, έχουν κοινή εμβρυολογική προέλευση εκ του εξωδέρματος. Κοινό εργαστηριακό εύρημα στους ασθενείς που πάσχουν και από τις δύο παθήσεις, είναι η παρουσία αυτοαντισωμάτων στον ορό τους, έναντι κυρίως της πρωτεΐνης BP180 (Col17). Η πρωτεΐνη BP180 έχει κυτταρογενετική θέση στο γονίδιο COL17A1 του χρωμοσώματος 10 (10q25.1) και ο κυριότερος ρόλος της είναι ως δομικό συστατικό των ημιδεσμοσωματίων. Συναντάται επίσης ως δομικό υλικό και στο κεντρικό νευρικό σύστημα, καθώς και σε άλλους ιστούς με άγνωστη όμως λειτουργία. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διερεύνηση της πιθανής συσχέτισης της γενετικής ποικιλότητας του γονιδίου COL17A1, με την εκδήλωση πομφολυγώδους πεμφιγοειδούς σε ασθενείς με νευρολογικές παθήσεις. Η μελέτη αποσκοπεί στην έρευνα της υπόθεσης ότι η πρωτεΐνη Col17 (BP 180) λειτουργεί ως κοινό αντιγόνο που πυροδοτεί μια ανοσολογική απόκριση έναντι του δέρματος και του κεντρικού νευρικού συστήματος. Η γενετική ποικιλότητα μπορεί να επηρεάσει την έκφραση της πρωτεΐνης, καθώς και στην περίπτωση υποκατάστασης κάποιου αμινοξέος, την ικανότητα των μορίων MHC να παρουσιάσουν το κολλαγόνο XVII στο ανοσοποιητικό σύστημα και την τάση των περιφερειακών αυτοαντισωμάτων να δεσμεύονται με το μόριο. Για το γονίδιο COL17A1 έχουν ταυτοποιηθεί έως τώρα 19 παραλλαγές μεμονωμένων νουκλεοτιδίων (SNVs) εκ των οποίων οι 3 αφορούν αλλαγές σε κωδικές περιοχές του γονιδιώματος και οδηγούν σε υποκατάσταση αμινοξέος (rs805708, rs805722, rs17116350). Στην παρούσα μελέτη έγινε γονοτύπηση των 3 αυτών παραλλαγών σε 4 ομάδες ασθενών: 1. Ασθενείς με ΠΠ και νευρολογικά νοσήματα (BPN - 61 ασθενείς), 2. Ασθενείς με ΠΠ (BP - 57 ασθενείς), 3. Ασθενείς με νευρολογικά νοσήματα (N - 53 ασθενείς), 4. Υγιείς μάρτυρες (C - 60 άτομα). Ο έλεγχος της γενετικής ποικιλότητας έγινε με τη χρήση μοριακών τεχνικών. Από όλους τους συμμετέχοντες της μελέτης, μετά την συγκατάθεσή τους, έγινε λήψη δείγματος αίματος. Από το κάθε δείγμα απομονώθηκε το γονιδιακό DNA. Με τη χρήση της τεχνικής της PCR πραγματοποιήθηκε πολλαπλασιασμός των 3 τμημάτων του γονιδίου COL17A1 που περιλαμβάνουν τα 3 προς εξέταση εξώνια. Για κάθε εξώνιο χωριστά, χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές περιοριστικές ενδονουκλεάσες, ώστε να ταυτοποιηθεί η αλληλουχία στην θέση της παραλλαγής. Από την στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων, δεν κατέστη δυνατή η εξαγωγή ασφαλούς συμπεράσματος για την υπόθεση της συσχέτισης της γενετικής ποικιλότητας του γονιδίου COL17A1 με την εκδήλωση πομφολυγώδους πεμφιγοειδούς σε ασθενείς με νευρολογικές παθήσεις. Οι περισσότερες συγκρίσεις δεν φάνηκε να έχουν στατιστική σημαντικότητα. Ανευρέθηκαν ορισμένες στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις, οι οποίες όμως δε μπορούν από μόνες τους να αξιολογηθούν, λόγω της μη ισορροπίας Hardy – Weinberg μεταξύ των υγιών μαρτύρων για την παραλλαγή αυτή και της επικράτησής της στον υπό μελέτη πληθυσμό. Αξιόλογο εύρημα ήταν η επικράτηση της παραλλαγής rs805722 του εξωνίου 27 στον υπό μελέτη πληθυσμό. Η επικράτηση αυτή επηρεάζει αρνητικά την στατιστική ανάλυση των δειγμάτων, οδηγώντας σε πιθανό στατιστικό σφάλμα. Εξίσου σημαντικό αποτέλεσμα, ήταν η αυξημένη πιθανότητα εμφάνισης νευρολογικού νοσήματος στους ασθενείς που εμφανίζουν την παραλλαγή rs805708 του εξωνίου 10, κατά 1.6 φορές. Στην βασική ομάδα ελέγχου BPN ανιχνεύθηκαν 10 ασθενείς με αρνητικό τίτλο αντισωμάτων (ELISA) έναντι των πρωτεϊνών BP 180 και BP 230. Στους ασθενείς αυτούς, αφού εξαιρέθηκαν από την ομάδα της μελέτης, ελέγχθηκε ο ορός του αίματος με την τεχνική της ανοσοαποτύπωσης (Western Blot) για την παρουσία νέων αντιγονικών επιτόπων. Στον ορό των ασθενών ανευρέθηκαν αντισώματα έναντι πρωτεϊνών δέρματος (dermal extract) διαφόρων μοριακών βαρών, οι οποίες όμως δεν κατέστη δυνατό να ταυτοποιηθούν. Ακόμη, δεν έχει αποσαφηνιστεί το κατά πόσο η μία νόσος προηγείται της άλλης, ή κατά πόσο αμφότερες είναι το αποτέλεσμα άλλων παθογενετικών μονοπατιών και αιτιών. Χρειάζεται περαιτέρω έρευνα για να αναγνωριστεί ο ανοσολογικός συνδετικός κρίκος μεταξύ των νευροεκφυλιστικών νοσημάτων και του πομφολυγώδους πεμφιγοειδούς.