Functional and structural analysis of tRNA-mediated gene regulation in pathogens

Abstract

tRNA-mediated regulation of transcription is widespread among Gram-positive bacteria and involves specific RNA-RNAs interactions which sense both charged and uncharged tRNAs. This intricate mechanism relies on the interaction between tRNA molecules, and the T-box regulatory leader element, termed T-box riboswitch, at the 5' untranslated region (UTR) of mRNA molecules. This interaction controls the expression of a wide array of genes responsible for amino acid transport, biosynthesis, and tRNA aminoacylation. Through a conformational switch triggered by tRNA binding, T-box riboswitches flip between two distinct conformations known as “terminator/ sequestrator” and “antiterminator/ antisequestrator” and allow or stall transcription or translation of the downstream genes under control. The T-box:tRNA mediated regulatory mechanism involves the initial recognition of the cognate tRNA molecule by the Specifier loop within the Stem I region, through a codon-anticodon like interaction. This contact is further stabilised by additional contacts of the tRNA elbow and the apical loop, which in turn depends on the AG bulge of Stem I. Finally, the T-box interacts with the tRNA 3′ end with a “discriminator” structure and interrogates its aminoacylation status using a steric sieve provided by a conserved wobble base-pair. In the absence of aminoacylation the transcription or translation is allowed. The presence of an amino acid on the other hand, interferes with tRNA-T-box stacking and inhibits gene expression. T-boxes are dynamic regulatory elements that control several essential genes for bacterial metabolism, and therefore represent promising RNA targets for the development of novel antibacterials to combat drug resistance. In staphylococci, the glyS T-box interacts with five tRNAGly isoacceptors to regulate glycine supply during synthesis of nascent proteins, as well as the synthesis of pentaglycine peptides that stabilize cell wall formation. This T-box is characterized by a distinct and conserved insertion within its antiterminator/terminator domain, known as Stem Sa. Notably in Staphylococcus aureus, Stem Sa region can interact with specific antibiotics and affects T-box-mediated transcription. The significance of Stem Sa was investigated by domain swap mutagenesis and probing analyses. The deletion of Stem Sa resulted in a significant reduction in the S. aureus glyS T-box- mediated transcription and abolished the ability to discriminate among different tRNAGly isoacceptors, both in vitro and in vivo. Additionally, the deletion inverted the previously observed stimulatory effects of tigecycline on transcription. However, the introduction of Stem Sa in Geobacillus kaustophilus glyQ T-box, which naturally lacks this domain, led to enhanced transcription in the presence of tigecycline and the presence of Stem Sa facilitated discrimination between proteinogenic and nonproteinogenic tRNAGly isoacceptors. Overall, it was shown Stem Sa represents a lineage-specific structural feature which distinguishes glyS T-boxes in staphylococci from other species and is essential for the proper function of S. aureus glyS T-box. To get insights on the biological role of the tRNAGly isoacceptor genes redundancy in S. aureus, the CRISPR/Cas9 genome editing tool was used to knock out P1 tRNAGlyGCC and NP tRNA genes cluster. Notably, depletion of the NP tRNA cluster was found to be lethal. In contrast, the depletion of P1 tRNAGly did not have any noticeable impact on the growth rate of S. aureus, although the edited strain exhibited increased susceptibility to antibiotics targeting the cell wall. Transcriptomic analysis of the edited strain revealed downregulation of genes implicated in the biosynthesis of amino acids and vitamins, as well as differentially expression of genes required for the iron homeostasis. Also, several crucial genes involved in cell wall formation and antibiotic resistance were significantly downregulated. These suggest that tRNAs are important regulators of bacterial homeostasis and reveals the tRNA-mediated interconnection of distinct cellular processes. Moreover, to investigate their role in the correct folding and proper function of T-box riboswitches, point mutations were introduced at conserved nucleotides that participate in the “discriminator” structure of G. kaustophilus glyQ T-box. In addition, structural and functional analysis of the glycyl T-boxes from four representative human pathogens Clostridium tetani, Listeria monocytogenes, Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pyogenes was performed and showed that despite their structural peculiarities, all four T-boxes responded to glycine starvation in vivo. Subsequent probing analysis revealed that the secondary structures of streptococcal T-boxes deviate from the other two which follow the typical T-box structural pattern. The K-turn motif observed absent from both streptococcal T-boxes, the S. pneumoniae glyQS T-box bears an unusually short linker and notably the S. pyogenes glyQS T-box contains a Stem II domain that is typically absent from glycyl T-boxes. Finally, a synthetic compound that specifically targets the apical loop of stem I was identified after in silico analysis and in vitro and in vivo screening. The compound, termed arrêT-box, inhibits S. aureus growth by specifically targeting T-box riboswitches and more importantly, does not induce resistance. Transcriptomic analysis of cultures in the presence of the compound revealed that affects several crucial cellular processes such as translation, several biosynthetic processes and stress response, and represents a promising leading candidate for the development of novel antibacterial compounds. In conclusion, the present thesis provides novel information regarding the structure and function of T-box riboswitches from different bacteria with an emphasis in pathogens. The results support and highlight the diversity of structural features among different T-boxes that mirror the variation in metabolic adaptation among pathogens. Finally, the broader characterization of several T-boxes from a variety of representative pathogenic bacteria is essential and guides the development and optimization of novel antibiotics that target T-boxes.

Η tRNA-διαμεσολαβούμενη ρύθμιση της μεταγραφής είναι διαδεδομένη στα Gram θετικά βακτήρια και περιλαμβάνει ειδικές RNA-RNA αλληλεπιδράσεις με φορτισμένα και μη μόρια tRNA. Αυτός ο μηχανισμός βασίζεται στην αλληλεπίδραση μεταξύ των μορίων tRNA και του ρυθμιστικού στοιχείου T-box που βρίσκεται στην 5' αμετάφραστη περιοχή των μορίων mRNA. Αυτή η αλληλεπίδραση ελέγχει την έκφραση ενός ευρέος φάσματος γονιδίων που είναι υπεύθυνα για τη μεταφορά και τη βιοσύνθεση αμινοξέων και την αμινοακυλίωση των μορίων tRNA. Μέσω μίας αλλαγής στη διαμόρφωση που μεσολαβείται από τη δέσμευση μορίων tRNA, οι T-boxes υιοθετούν δύο διακριτές διαμορφώσεις και ελέγχουν είτε τη μεταγραφή είτε τη μετάφραση των καθοδικών τους γονιδίων. Ο ρυθμιστικός μηχανισμός περιλαμβάνει την αρχική αναγνώριση ενός μορίου tRNA από τον βρόχο εξειδίκευσης του T-box, μέσω συμπληρωματικότητας μεταξύ του κωδικονίου εξειδίκευσης και του αντικωδικονίου του μορίου tRNA. Αυτή η αλληλεπίδραση σταθεροποιείται με πρόσθετες επαφές της δομής αγκώνα του tRNA και του κορυφαίου βρόχου του T-box. Τέλος, ο T-box αλληλεπιδρά με το 3' άκρο του tRNA και ανιχνεύει την κατάσταση αμινοακυλίωσής του. Απουσία αμινοξέος επιτρέπεται η μεταγραφή ή μετάφραση, ενώ η παρουσία ενός αμινοξέος, αναστέλλει την έκφραση των γονιδίων. Οι T-boxes, ως δυναμικά ρυθμιστικά στοιχεία που ελέγχουν σημαντικά γονίδια του βακτηριακού μεταβολισμού, αποτελούν πολλά υποσχόμενους και καινοτόμους αντιβακτηριακούς στόχους.Στους σταφυλόκοκκους, ο glyS T-box αλληλεπιδρά με πέντε ισοδεκτικά μόρια tRNAGly και συντονίζει την παροχή γλυκίνης τόσο κατά την πρωτεϊνοσύνθεση όσο και κατά το σχηματισμό των γεφυρών πενταγλυκίνης του κυτταρικού τοιχώματος Αυτός ο T-box φέρει στην περιοχή τερματισμού/αντιτερματισμού ένα είδο-ειδικό στέλεχος Sa, το οποίο στο Staphylococcus aureus μπορεί να αλληλεπιδράσει με συγκεκριμένα αντιβιοτικά και να επηρεάσει άμεσα την T-box μεσολαβούμενη μεταγραφή. Η σημασία του στελέχους Sa διερευνήθηκε με μεταλλαξιγένεση και η διαγραφή του οδήγησε σε σημαντική μείωση της S. aureus glyS T-box μεσολαβούμενης μεταγραφής και κατάργησε την ικανότητα διάκρισης μεταξύ των διαφορετικών ισοδεκτικών μορίων tRNAGly, τόσο in vitro όσο και in vivo. Επιπρόσθετα, η διαγραφή του ανέστρεψε τις προηγουμένως παρατηρηθείσες διεγερτικές επιδράσεις της τιγεκυκλίνης στη μεταγραφή. Ωστόσο, η εισαγωγή του στελέχους Sa στο Geobacillus kaustophilus glyQ T-box, οδήγησε σε ενισχυμένη μεταγραφή παρουσία τιγεκυκλίνης και η παρουσία του διευκόλυνε τη διάκριση μεταξύ πρωτεϊνογενετικών και μη ισοδεκτικών μορίων tRNAGly. Συνολικά, φάνηκε ότι το στέλεχος Sa αποτελεί ένα σημαντικό ειδό-ειδικό δομικό στοιχείο, απαραίτητο για τη σωστή λειτουργία του S. aureus glyS T-box. Προκειμένου να διερευνηθεί ο βιολογικός ρόλος του γονιδιακού πλεονασμού για τα μόρια tRNAGly στο S. aureus, χρησιμοποιήθηκε το εργαλείο γονιδιωματικής επεξεργασίας CRISPR/Cas9 για την απαλοιφή του ενός γονιδίου για το P1 tRNAGlyGCC και του συμπλέγματος γονιδίων για τα NP tRNA. Συγκεκριμένα, η απαλοιφή των NP tRNAs βρέθηκε να μην είναι βιώσιμη για το κύτταρο. Αντίθετα, η απαλοιφή του γονιδίου του P1 tRNAGly δεν επηρέασε το ρυθμό ανάπτυξης του S. aureus, αν και το επεξεργασμένο στέλεχος εμφάνισε αυξημένη ευαισθησία στα αντιβιοτικά που στοχεύουν το κυτταρικό τοίχωμα. Η ανάλυση του μεταγραφώματος του επεξεργασμένου στελέχους αποκάλυψε μείωση της ρύθμισης των γονιδίων που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση αμινοξέων και βιταμινών, καθώς και τη διαφορική έκφραση γονιδίων που απαιτούνται για την ομοιόσταση του σιδήρου, το σχηματισμό του κυτταρικού τοιχώματος την αντίσταση στα αντιβιοτικά. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι τα μόρια tRNA είναι σημαντικοί ρυθμιστές της βακτηριακής ομοιόστασης και αποκαλύπτουν τη tRNA-διαμεσολαβούμενη διασύνδεση διακριτών κυτταρικών διεργασιών. Επιπλέον, σημειακές μεταλλάξεις σε συντηρημένα νουκλεοτίδια που συμμετέχουν στη δομή «διάκρισης» του G. kaustophilus glyQ T-box χρησιμοποιήθηκαν για να διερευνηθεί ο ρόλος τους στη σωστή λειτουργία των T-boxes. Επιπρόσθετα, διεξήχθη δομική και λειτουργική ανάλυση των T-boxes της γλυκίνης από τέσσερα αντιπροσωπευτικά παθογόνα για τον άνθρωπο βακτήρια, Clostridium tetani, Listeria monocytogenes, Streptococcus pneumoniae και Streptococcus pyogenes. Και οι τέσσερις T-boxes ανταποκρίθηκαν στην έλλειψη γλυκίνης in vivo. Η δομική ανάλυση αποκάλυψε ότι οι δευτεροταγείς δομές των T-boxes των στρεπτόκοκκων αποκλίνουν από τις άλλες δύο που ακολουθούν το τυπικό δομικό T-box πρότυπο. Το μοτίβο K-turn φάνηκε να απουσιάζει και από τους δύο T-boxes των στρεπτόκοκκων, ο S. pneumoniae glyQS T-box φέρει μία ασυνήθιστα βραχεία περιοχή συνδέτη και ο S. pyogenes glyQS Τ-box περιέχει ένα στέλεχος ΙΙ, που τυπικά απουσιάζει από του T-box ριβοδιακόπτες της γλυκίνης. Τέλος, μια συνθετική ένωση που στοχεύει ειδικά τον κορυφαίο βρόχο του στελέχους Ι εντοπίστηκε στην παρούσα διατριβή, μετά από in silico, in vitro και in vivo αναλύσεις. H ένωση που ονομάστηκε arrêT-box, αναστέλλει την ανάπτυξη του S. aureus στοχεύοντας ειδικά τους T-boxes και η πιο σημαντικό παρατήρηση ήταν ότι δε φάνηκε να προκαλεί ανθεκτικότητα. Η ανάλυση του μεταγραφώματος του S. aureus παρουσία της ένωσης αποκάλυψε ότι περισσότερα από τα μισά γονίδια του S. aureus παρουσιάζουν διαφορική έκφραση και επηρεάζουν αρκετές κρίσιμες κυτταρικές διεργασίες όπως τη μετάφραση, αρκετές βιοσυνθετικές διαδικασίες και την απόκριση στο στρες, θέτοντάς την ως υποψήφια για την ανάπτυξη νέων αντιβακτηριακών ενώσεων. Συνολικά, η παρούσα διατριβή παρέχει καινοτόμες πληροφορίες σχετικά με τη δομή και τη λειτουργία των T-box ριβοδιακοπτών από διαφορετικά παθογόνα βακτήρια. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν μια ποικιλομορφία των δομικών χαρακτηριστικών μεταξύ διαφορετικών T-boxes που αντικατοπτρίζουν τις διαφορές στη προσαρμογή μεταξύ των παθογόνων. Ο ευρύτερος χαρακτηρισμός T-boxes από μια ποικιλία παθογόνων βακτηρίων, θα βοηθήσει την ανάπτυξη και τη βελτιστοποίηση των T-box στοχευμένων αντιβιοτικών.