Ανάπτυξη συστήματος τεχνητής παραγωγής βιογενών ελευθέρων ριζών για την προσομοιωμένη μελέτη των οξειδωτικών τροποποιήσεων σε κρίσιμα βιομόρια σε συνδυασμό με την αντιοξειδωτική κατάσταση των διαφόρων βιολογικών συστημάτων

Abstract

Hydroxyl (•OH) and superoxide (O2•−) radicals are key parameters responsible for oxidative stress (OS) generation in all aerobic organisms. Thus, studies exploring their in vitro oxidative effects in biological systems are of great interest in Biology, Medicine, Pharmaceuticals, and other research fields like Chemistry, Physics and Astrobiology. However, simulation study of the in vitro effects of •OΗ and O2•−, using specifically and independently controlled in vitro production systems, is unfeasible with existing methods (e.g., •OΗ-producing Fenton system and O2•−-producing xanthine oxidase system), since they are not only uncontrollable but the produce/use other OS parameters (e.g., H2O2 in Fenton). In the present doctoral dissertation, a photoexcited TiO2 nanoparticle-based (TiO2-NP) system was developed for the controlled and specific production of •OΗ and O2•− at 1:1 molar ratio, in order to be used for in vitro biological simulations of high OS, caused by the two free radicals, mentioned above. More specific, the TiO2-NP was set to produce •OΗ and O2•− alone or both, as these options cover all their possible in vivo generation means. Moreover, the known non-specific electrostatic interactions of TiO2-NP with H2O and various biological systems (e.g., cells, membrane proteins) simulate the direct/distant interactions of any in vivo •OΗ and O2•− source with extra/intracellular biological targets, taking place in a densely packed biomolecular environment. The TiO2-NP system was calibrated by a standardized protocol developed to be applicable to most biological systems. The production rates of •OΗ and O2•− by the TiO2-NP system were specifically calibrated with their respective specific probes terephthalic acid (TPA) and hydroethidine (HE) and tested in comparison to the •OΗ-producing Fenton system. The reaction kinetics of •OΗ and O2•− with TPA and HE was found to undergo competition interactions with their generating source, the TiO2-NP system. Similar Reactive Oxygen Species (ROS) source competition phenomena with biological are very common in biological systems and, hence, the TiO2-NP system acts as their simulator with TPA/HE, which was not kinetically determined for the Fenton system. The TiO2-NP system can be used for the simulation, dose-response-depended study of oxidative modifications caused in each molecular component of all biological systems by •OΗ and O2•−. This stems from the fact that •OΗ and O2•− proportional linear production rates (60 min and up to 8 min, respectively) can be controlled by varying (i) TiO2 concentration, (ii) emission energy of each photon of the light-source, and (iii) light intensity. In contrast, •OΗ production by the Fenton system was maximized to ~5 sec regardless of varying Fe-II concentration. The TiO2-NP system producing both •OΗ and O2•−, was tested on the indicative biological examples bovine serum albumin (BSA), a model hydrophilic protein and low-density lipoprotein (LDL), structurally resembling most of the biological systems (e.g., cells, membranes, organelles). The TiO2-NP system caused a linear increase of all the tested oxidative modifications on both BSA and LDL for exposure of 20 to 40 min, suggesting that they are mainly •OΗ dose-proportional. In contrast, the Fenton system did not display •OΗ dose-associated oxidative modifications on BSA. The TiO2-NP system was also used for the in vitro investigation of •OH and/or O2•− effect on human insulin (HI) structure (assessed via single crystal X-ray diffraction), by identifying on HI the dityrosine (Tyr-Tyr) formation, fragmentation, and cross-linking. •OΗ, but not O2•−, dose exposure progressively affected HI crystallization extend, while it was proportionally correlated with Tyr-Tyr formation and HI aggregation (fragmentation to a much lesser extend). Focusing on HI structure profiles vs •OH dose exposure, they showed no structural modifications of the molecules, or alterations in specific amino acids prone to radical exposure action, leading to the conclusion that the crystals studied were formed from molecules that have not undergone oxidative modifications.

Οι ελεύθερες ρίζες υδροξυλίου (•OH) και σουπεροξειδίου (O2•−) είναι βασικές παράμετροι της πρόκλησης οξειδωτικού stress (ΟΣ) σε όλους τους αερόβιους οργανισμούς. Συνεπώς, οι μελέτες για τη διερεύνηση in vitro των οξειδωτικών τους επιδράσεων σε βιολογικά συστήματα παρουσιάζουν μεγάλο ενδιαφέρον στη ΒιολογίαΙατρική και Φαρμακευτική, αλλά και σε πολλές άλλες γνωστικές περιοχές όπως η Χημεία, η Φυσική και η Αστροβιολογία. Ωστόσο, η προσομοιωμένη μελέτη των in vitro επιδράσεων των •OH και O2•−, μέσω της εξειδικευμένης και ανεξάρτητα ελεγχόμενης in vitro παραγωγής τους δεν είναι εφικτή με τις υφιστάμενες μεθόδους (π.χ., της •OH με το σύστημα Fenton και της O2•− με το σύστημα οξειδάσης της ξανθίνης), διότι όχι μόνο δεν ελέγχουν τους ρυθμούς παραγωγής των •OH και O2•−, αλλά παράγουν/χρησιμοποιούν και άλλες παραμέτρους ΟΣ (π.χ. H2O2 από το σύστημα Fenton). Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, αναπτύχθηκε ένα σύστημα φωτοδιεγειρόμενων νανοσωματιδίων TiO2 (TiO2-NP) για την απολύτως ελεγχόμενη και εξειδικευμένη παραγωγή •OH και O2•−, σε μοριακή αναλογία 1:1, προκειμένου να χρησιμοποιηθεί για in vitro βιολογικές προσομοιώσεις πρόκλησης υψηλού ΟΣ από αυτές τις ελεύθερες ρίζες. Ειδικότερα, το σύστημα TiO2-NP αναπτύχθηκε ώστε να παράγει •OH και O2•−, ταυτόχρονα ή μεμονωμένα, καθώς αυτές οι επιλογές προσομοιώνουν όλους τους in vivo συνδυασμούς παραγωγής τους. Επιπλέον, οι γνωστές μη ειδικές ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις του TiO2-NP με το H2O και διάφορα βιολογικά συστήματα (π.χ., κύτταρα, διαμεμβρανικές πρωτεΐνες) προσομοιώνουν τις εστιακές/απομακρυσμένες αλληλεπιδράσεις οποιασδήποτε in vivo εστιακής πηγής •OH και O2•− με τους εξω/ενδοκυτταρικούς βιολογικούς τους στόχους, οι οποίες λαμβάνουν χώρα στο πυκνό κυτταρικό περιβάλλον. Για το σύστημα TiO2-NP αναπτύχθηκε ένα τυποποιημένο πρωτόκολλο με σκοπό να είναι εφαρμόσιμο στα περισσότερα βιολογικά συστήματα. Οι ταχύτητες παραγωγής των •OH και O2•− από το σύστημα TiO2-NP ποσοτικοποιήθηκαν με τη χρήση των εξειδικευμένων μορίων-ανιχνευτών τους τερεφθαλικό οξύ (TPA) και διυδροαιθίδιο (HE), αντίστοιχα, και συγκρίθηκαν με τον ρυθμό παραγωγής •OH από το σύστημα Fenton. Διαπιστώθηκε ότι η κινητική των αντιδράσεων •OH και O2•− με τα TPA και HE υπόκειται σε συναγωνισμό αλληλεπιδράσεων με την πηγή παραγωγής τους, το σύστημα TiO2-NP. Παρόμοια φαινόμενα συναγωνισμού πηγών δραστικών μορφών οξυγόνου (Reactive Oxygen Species/ROS) με βιολογικούς στόχους είναι πολύ συνηθισμένα στα βιολογικά συστήματα, και ως εκ τούτου το σύστημα TiO2-NP παράλληλα αποτελεί προσομοιωτή τους με τα TPA/HE, κάτι που δεν διαπιστώθηκε κινητικά με το σύστημα Fenton. Το σύστημα TiO2-NP μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την προσομοιωμένη μελέτη δοσο-εξαρτώμενων οξειδωτικών τροποποιήσεων στα επιμέρους βιολογικά συστήματα όλων των βιολογικών συστημάτων από τις •OH και O2•−. Αυτό συμπεραίνεται από το γεγονός ότι οι αναλογικοί γραμμικοί ρυθμοί παραγωγής •OH και O2•− (60 min και έως 8 min, αντίστοιχα) μπορούν να ελεγχθούν μεταβάλλοντας (α) τη συγκέντρωση TiO2, (β) την ενέργεια εκπομπής εκάστου των φωτονίων της φωτεινής πηγής και (γ) την ένταση του φωτός. Αντίθετα, η παραγωγή •OH από το σύστημα Fenton μεγιστοποιήθηκε σε ~5 sec ανεξάρτητα από τη μεταβολή της συγκέντρωσης Fe-II. Το σύστημα TiO2-NP, παράγοντας •OH και O2•−, δοκιμάστηκε ενδεικτικά σε αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA, πρότυπη υδρόφιλη πρωτεΐνη) και τη λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας (LDL, δομική ομοιότητα με τα περισσότερα βιολογικά συστήματα, π.χ., κύτταρα, μεμβράνες, οργανίδια). Το σύστημα TiO2-NP προκάλεσε γραμμική αύξηση όλων των εξεταζόμενων οξειδωτικών τροποποιήσεων τόσο στην BSA όσο και στην LDL για έκθεση από 20 έως 40 min, γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι κυρίως δοσο-εξαρτώμενες από την •OH. Αντίθετα, το σύστημα Fenton δεν εμφάνισε, δοσο-εξαρτώμενες από την •OH , τροποποιήσεις στη BSA. Επίσης, το σύστημα TiO2-NP χρησιμοποιήθηκε για την in vitro διερεύνηση της επίδρασης των •OH ή/και O2•−, στη δομή της ανθρώπινης ινσουλίνης (HI) (η οποία αξιολογήθηκε μέσω της κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ), προσδιορίζοντας στη HI τον κατακερματισμό της και το σχηματισμό cross-links διτυροσίνης (Tyr-Tyr). Η έκθεση στην •OH, αλλά όχι στην O2•−, επηρέασε προοδευτικά τη δυνατότητα κρυστάλλωσης της HI, ενώ συσχετίστηκε αναλογικά με το σχηματισμό Tyr-Tyr και τη συσσωμάτωση της HI (με τον κατακερματισμό της σε πολύ μικρότερη έκταση). Εστιάζοντας στη δομής της HI, σε σχέση με την έκθεση στην •OH, δεν εντοπίστηκαν δομικές τροποποιήσεις των μορίων ή μεταβολές σε επιρρεπή στην οξείδωση αμινοξέα, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι οι κρύσταλλοι που μελετήθηκαν σχηματίστηκαν από μόρια που δεν έχουν υποστεί οξειδωτικές τροποποιήσεις.