Investigations on the role of SAF-A in the epigenetic regulation of nuclear architecture

Abstract

Chromatin is a dynamic structure involved in various cellular processes. By studying the molecular mechanisms and epigenetic modifications that regulate chromatin architecture, we can gain insights into how cells adapt to changing environments, and how dysregulation of these processes can lead to pathological conditions. In the present thesis we have focused on one of the most important chromatin-regulator proteins, called Scaffold Attachment Factor A (SAF-A), and more specifically on the interaction of SAF-A with nuclear actin. Earlier studies have shown that SAF-A and actin are able to directly interact and modulate transcription by regulating the phosphorylation of the CTD domain of RNA Polymerase II. Recent data have also revealed that a mutation in the actin-binding domain of SAF-A leads to neurodevelopmental disorders. To gain more insight into the role of SAF-A-actin interaction, we applied novel CRISPR/Cas techniques to tag endogenous proteins and observe their interactions in living cells. By using live-cell imaging and photobleaching experiments we demonstrated that the overexpression of SAF-A or mutated constructs of SAF-A leads to the accumulation of globular actin into splicing speckles. On the other hand, we utilized the mAID system to rapidly deplete SAF-A within a few hours, and examined the effects on actin by using all the validated published tools to express, visualize, and measure actin. Our experiments revealed that upon SAF-A depletion there is a significant enrichment of actin in the nucleus, resulting in the formation of nuclear actin filaments, but also an enrichment of stress fibers in the cytoplasm, enhancing the migration of cells. Additional experiments aimed at the mechanism of how SAF-A modulates actin localization and polymerization point to the involvement of SAF-A in the exporting pathway of actin out of the nucleus. The results of this thesis lay a solid ground for understanding the mechanism of interaction of SAF-A and nuclear actin, and how this interaction can affect chromatin architecture and gene expression. Future research will show how the interaction is involved in human disease, and how the gained knowledge may be translated into medical applications.

Η χρωματίνη είναι μια δυναμική δομή που εμπλέκεται σε διάφορες κυτταρικές διεργασίες. Μελετώντας τους μοριακούς μηχανισμούς και τις επιγενετικές τροποποιήσεις που ρυθμίζουν την αρχιτεκτονική της χρωματίνης, μπορούμε να αποκτήσουμε γνώσεις για το πώς τα κύτταρα προσαρμόζονται σε μεταβαλλόμενα περιβάλλοντα και πώς η απορρύθμιση αυτών των διεργασιών μπορεί να οδηγήσει σε παθολογικές καταστάσεις. Στην παρούσα διατριβή εστιάσαμε σε μια από τις πιο σημαντικές πρωτεΐνες ρυθμιστή της χρωματίνης, που ονομάζεται Scaffold Attachment Factor A (SAF-A), ή αλλιώς hnRNPU, και πιο συγκεκριμένα στην αλληλεπίδραση της SAF-A με την ακτίνη που εντοπίζεται στον πυρήνα. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η SAF-A και η ακτίνη είναι σε θέση να αλληλεπιδρούν άμεσα και να ρυθμίζουν τη μεταγραφή ρυθμίζοντας τη φωσφορυλίωση της περιοχής CTD της RNA Πολυμεράσης II. Πρόσφατα δεδομένα έχουν επίσης δείξει ότι μια μετάλλαξη στην θέση δέσμευσης ακτίνης της SAF-A μπορεί να οδηγήσει σε νευροαναπτυξιακές διαταραχές. Για να αποκτήσουμε περισσότερες πληροφορίες σχετικά με το ρόλο της αλληλεπίδρασης της SAF-A με την ακτίνη, εφαρμόσαμε νέες τεχνικές CRISPR/Cas για να σημάνουμε τις ενδογενείς πρωτεΐνες και να παρατηρήσουμε τις αλληλεπιδράσεις τους σε ζωντανά κύτταρα. Με τη χρήση πειραμάτων απεικόνισης ζωντανών κυττάρων και φωτολεύκανσης δείξαμε ότι η υπερέκφραση της SAF-A ή μεταλλαγμένων μορφών της (που κατασκευάστηκαν στο εργαστήριο) οδηγεί στη συσσώρευση της μονομερούς ακτίνης στα πυρηνικά σωματίδια ματίσματος. Από την άλλη πλευρά, χρησιμοποιήσαμε το σύστημα mAID για να επιτύχουμε ταχεία αποικοδόμηση της SAF-A μέσα σε λίγες ώρες και εξετάσαμε την επίδραση της αποικοδόμησης στην ακτίνη χρησιμοποιώντας όλα τα επικυρωμένα δημοσιευμένα εργαλεία για την έκφραση, την οπτικοποίηση και τη μέτρηση της ακτίνης. Τα πειράματά μας αποκάλυψαν ότι με την αποικοδόμηση της SAF-A υπάρχει σημαντικός εμπλουτισμός της ακτίνης στον πυρήνα, που οδηγεί στον σχηματισμό πολυμερών ινιδίων ακτίνης, αλλά και στον εμπλουτισμό των ινιδίων τάσης ακτίνης στο κυτταρόπλασμα, ενισχύοντας τη μετανάστευση των κυττάρων. Πρόσθετα πειράματα που στοχεύουν στον μηχανισμό του τρόπου με τον οποίο η SAF-A ρυθμίζει τον εντοπισμό και τον πολυμερισμό της ακτίνης δείχνουν τη συμμετοχή της SAF-A στο μονοπάτι εξαγωγής της ακτίνης από τον πυρήνα. Τα αποτελέσματα αυτής της διατριβής αποτελούν ένα στέρεο έδαφος για την κατανόηση του μηχανισμού αλληλεπίδρασης της SAF-A και της ακτίνης και πώς αυτή η αλληλεπίδραση μπορεί να επηρεάσει την αρχιτεκτονική της χρωματίνης και την έκφραση γονιδίων. Η μελλοντική έρευνα θα δείξει πώς εμπλέκεται η αλληλεπίδραση αυτή στην ανθρώπινη παθοφυσιολογία και πώς η αποκτηθείσα γνώση μπορεί να μεταφραστεί σε ιατρικές εφαρμογές.