Μελέτη του υποδοχέα anaplastic lymphoma kinase στην αγγειογένεση, ως στόχου για θεραπευτικές προσεγγίσεις

Abstract

Angiogenesis, the process of creating new blood vessels, plays an important role in the normal functioning of the body and cancer. Angiogenesis inhibitors are used as anticancer therapy, but some patients develop resistance or disease progression. A factor that has been studied in recent years and appears to play an important regulatory role in the process of normal and cancer angiogenesis is pleiotrophin (PTN), through its receptor with tyrosine phosphatase activity PTPRZ1. The pathway activated downstream of PTPRZ1 is only partially elucidated and it may involve the activation of the ALK receptor. Anaplastic lymphoma kinase (ALK) is a receptor tyrosine kinase that is being studied as a therapeutic target in various types of cancer. ALK tyrosine kinase inhibitors, such as crizotinib, are already used in the treatment of non-small cell lung cancer, when specific ALK chimeric proteins are expressed, while recently ALK is also being studied as a therapeutic target for glioblastoma. The aim of this thesis is to investigate the role of ALK in angiogenesis, as a target for therapeutic approaches. For this purpose, studies were performed on endothelial cells derived from human umbilical vein or from lung capillaries of knockout mice for the PTPRZ1 gene (Ptptrz1-/-) as well as their wild-type counterparts. In addition, the role of ALK was studied in normal angiogenesis in vivo using the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) model, as well as in cancer angiogenesis using the urethane chemical lung carcinogenesis model. Pharmacological inhibitors of the ALK tyrosine kinase, such as crizotinib, were found to inhibit the increased angiogenic activities observed in Ptprz1-/- LMVEC endothelial cells or HUVECs following PTPRZ1 tyrosine phosphatase inhibition. They also inhibit VEGFA165- or PTN-induced endothelial cell functions such as proliferation, migration, Akt kinase activation and mitochondrial elongation. Crizotinib also inhibits the mitochondrial elongation observed in Ptprz1-/- LMVECs compared to Ptprz1+/+ LMVECs. PTN also induces mitochondrial elongation in HUVEC cells and crizotinib inhibits this effect. In conclusion, these results suggest that pharmacological inhibitors of ALK, such as crizotinib, inhibit the VEGFA and PTN induced angiogenic activities mediated by the PTPRZ1 receptor. However, it was not possible to detect ALK expression in Ptprz1-/- and Ptprz1+/+ LMVECs, nor its activation induced by VEGFA165 or PTN in any of the endothelial cell types studied. Therefore, further future studies and better pharmacological or biochemical tools are needed to elucidate any role of ALK in the direct regulation of angiogenesis.

Η αγγειογένεση, η διαδικασία δημιουργίας νέων αγγείων, παίζει σημαντικό ρόλο στη φυσιολογική λειτουργία του οργανισμού αλλά και τον καρκίνο. Αναστολείς της αγγειογένεσης χρησιμοποιούνται ως αντικαρκινική θεραπεία, αλλά ορισμένοι ασθενείς εμφανίζουν αντοχή ή επιδείνωση της νόσου. Ένας παράγοντας που μελετάται τα τελευταία χρόνια και φαίνεται να παίζει σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο στη διαδικασία φυσιολογικής και καρκινικής αγγειογένεσης είναι η πλειοτροπίνη (PTN), μέσω του υποδοχέα της με δράση φωσφατάσης τυροσίνης PTPRZ1. Το μονοπάτι που ενεργοποιείται καθοδικά του PTPRZ1 διαλευκανθεί μόνο μερικώς και ένα σκέλος του ίσως να αφορά στην ενεργοποίηση του υποδοχέα ALK. Η κινάση αναπλαστικού λεμφώματος (ΑLK) είναι ένας υποδοχέας κινάσης τυροσίνης που μελετάται ως θεραπευτικός στόχος σε διάφορους τύπους καρκίνου. Αναστολείς της κινάσης τυροσίνης του ALK, όπως είναι η κριζοτινίμπη, χρησιμοποιούνται ήδη στη θεραπευτική του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα, όταν εκφράζονται συγκεκριμένες χιμαιρικές πρωτεΐνες του ALK, ενώ τελευταία ο ALK μελετάται και ως θεραπευτικός στόχος για το γλοιοβλάστωμα. Στόχος τις παρούσας διατριβής είναι η διερεύνηση του ρόλου του ALK στην αγγειογένεση, ως στόχου για θεραπευτικές προσεγγίσεις. Για τον σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκαν μελέτες σε ενδοθηλιακά κύτταρα προερχόμενα από τη φλέβα ανθρώπινου ομφάλιου λώρου ή από τριχοειδή αγγεία πνεύμονα μύων knockout για το γονίδιο του PTPRZ1 (Ptptrz1-/-) αλλά και τα αντίστοιχα αγρίου τύπου. Επιπλέον, μελετήθηκε ο ρόλος του ALK στη φυσιολογική αγγειογένεση in vivo, χρησιμοποιώντας το μοντέλο της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας, καθώς και στην καρκινική αγγειογένεση με τη χρήση του μοντέλου χημικής καρκινογένεσης πνεύμονα με ουρεθάνη. Φαρμακολογικοί αναστολείς της κινάσης τυροσίνης του ALK, όπως η κριζοτινίμπη, βρέθηκαν να αναστέλλουν in vitro την ενεργοποίηση αγγειογενετικών διαδικασιών που παρατηρούνται στα ενδοθηλιακά κύτταρα Ptprz1-/- LMVEC ή στα HUVEC ύστερα από αναστολή της φωσφατάσης τυροσίνης του PTPRZ1. Αναστέλλουν, επίσης, τις επαγόμενες από VEGFA165 ή ΡΤΝ λειτουργίες των ενδοθηλιακών κυττάρων, όπως ο πολλαπλασιασμός, η μετανάστευση, η ενεργοποίηση της κινάσης Akt και η επιμήκυνση των μιτοχονδρίων. Η κριζοτινίμπη αναστέλλει και την επιμήκυνση των μιτοχονδρίων που παρατηρείται στα Ptprz1-/- LMVEC σε σύγκριση με τα Ptprz1+/+ LMVEC. Η ΡΤΝ επίσης επάγει την επιμήκυνση των μιτοχονδρίων στα κύτταρα HUVEC και η κριζοτινίμπη αναστέλλει αυτή τη δράση. Συμπερασματικά, από τα αποτελέσματα αυτά φαίνεται ότι φαρμακολογικοί αναστολείς του ALK, όπως η κριζοτινίμπη, αναστέλλουν τις αγγειογενετικές δράσεις του VEGFA και της ΡΤΝ που διαμεσολαβούνται από τον υποδοχέα PTPRZ1. Όμως, δεν κατέστη δυνατό να ανιχνευτεί η έκφραση του ALK στα Ptprz1-/- και στα Ptprz1+/+ LMVEC, ούτε η ενεργοποίησή του από τον VEGFA165 ή της ΡΤΝ σε κανέναν από τους τύπους ενδοθηλιακών κυττάρων που μελετήθηκαν. Επομένως, απαιτούνται περαιτέρω μελλοντικές μελέτες και καλύτερα φαρμακολογικά ή βιοχημικά εργαλεία για να αποσαφηνίσουν τυχόν ρόλο του ALK στη ρύθμιση της αγγειογένεσης.