Mελέτη παθοφυσιολογικών μηχανισμών σε μοντέλο SLC25A46-επαγόμενης νευρολογικής ασθένειας στο ποντίκι μέσω προσεγγίσεων μοριακής γενετικής και πρωτεομικής

Abstract

Mitochondrial protein SLC25A46, a member of the SLC25 family of mitochondrial carriers, has recently been associated with a wide range of autosomal recessive neurological disorders, including optic atrophy, Charcot-Marie-Tooth type 2, Leigh syndrome, progressive myoclonic ataxia, cerebellar ataxia, and lethal congenital pontocerebellar hypoplasia. Previous studies suggest the involvement of SLC25A46 in mitochondrial dynamics, in the maintenance of the mitochondrial cristae architecture and in mitochondrial communication with the endoplasmic reticulum (ER). However, the pathophysiological role of SLC25A46 remains unknown, making it difficult to understand the pathogenic mechanisms involved. Dr. Douni’s research team using a forward genetics approach, identified a nonsense point mutation in Slc25a46 gene that causes an autosomal recessive neurological phenotype in mouse (Slc25a46atc/atc) with similar clinical symptoms as in patients, including ataxia, episodic crises, unsteady locomotion, muscle weakness, optic atrophy, cerebellar hypoplasia, and delayed development with early lethality. In the present thesis, aiming to further understand the pathophysiological role of SLC25A46 we performed: a) characterization of the skeletal system of Slc25a46atc/atc mice, b) analysis of the mitochondrial activity in Slc25a46atc/atc cerebellum, brain, thymus and spleen in order to detect the effect of SLC25A46-depletion on mitochondrial function, c) identification of the deregulated protein networks and pathways in the cerebellum of Slc25a46atc/atc mice, as well as in an induced SLC25A46-knockdown cell line through proteomic analysis (LC-MS/MS) in order to understand the pathogenic mechanisms involved, d) generation and characterization of the transgenic mice that express SLC25A46-FLAG protein (TgSLC25A46-FLAG), e) identification of in vivo SLC25A46 interactions in mouse tissues of TgSLC25A46-FLAG mice, through immunoprecipitation with anti-FLAG beads and identification of protein complexes containing SLC25A46-FLAG by LC-MS/MS, f) evaluation of the effect of mutations on SLC25A46 protein interaction network by generating recombinant plasmids for SLC25A46 mutants, transient expression of the plasmids in N2A cells, immunoprecipitation with anti-FLAG beads and identification of protein complexes by proteomic analysis (LC-MS/MS).At first, histological and quantitative analysis by microCT of the femur of Slc25a46atc/atc mice, showed severe bone loss in both trabecular bone at metaphysis and cortical bone at diaphysis. Additionally, comparative mRNA expression analysis, in femurs of Slc25a46atc/atc and WT mice, showed increased expression of RANKL gene, an osteoclastogenesis inducer, and reduced expression of the osteoblast activity marker ALP, indicating a possible increase in osteoclastogenesis with reduced bone synthesis that could cause bone loss. Also, respiratory chain complex I genes showed a statistically significant increase in expression, suggesting a probable association of the osteoporotic phenotype with Slc25a46atc/atc mitochondrial dysregulation. Mitochondrial analysis in the cerebellum of Slc25a46atc/atc mice showed a reduction in reactive oxygen species levels and hyperpolarization of the mitochondrial membrane, while ATP concentration showed no differences. Then, comparative proteomic analysis was performed on whole protein extracts from the cerebellum of Slc25a46atc/atc and WT mice, revealing a significant decrease in respiratory chain proteins, mainly proteins from complexes I, III and IV, as well as an increase in proteins of mitochondrial dynamics and cristae organization, suggesting changes in the structure and function of mitochondria. In addition, dysregulated processes related to cellular metabolism, lipid, and calcium homeostasis, as well as neurogenesis and synapse function were found. At the same time, comparative proteomic analysis in an induced SLC24A46-knockdown cell line, showed that absence of SLC25A46 alters the expression of nuclear proteins, related to nucleic acid and chromatin processing, mitochondrial organization, and mitochondrial fusion proteins, as well as proteins of metabolism and energy production in the mitochondrion. To better understand the physiological role of SLC25A46 protein, transgenic mice expressing SLC25A46-FLAG protein (TgSLC25A46-FLAG) were generated and characterized, while the SLC25A46 protein interacting network was identified in cerebellum, cerebrum, heart, and thymus, through immunoprecipitation and proteomic analysis. The results of the present thesis confirmed SLC25A46 interactions with members of the MICOS complex, while showing for the first time that it also interacts with a large network of proteins, such as members of oxidative phosphorylation and F1F0-ATP synthase, mitochondrial-ER communication proteins, and synaptic vesicle proteins. Finally, SLC25A46 mutants were generated for point mutations identified in the patients. SLC25A46R257Q-FLAG protein which had a stable protein expression was used to identify its protein interactors network. The results showed that p.R257Q mutation maintains the majority of the SLC25A46 protein interactions (81%), including known SLC25A46 interactions such as IMMT. However, compared to wild type SLC25A46 the p.R257Q mutation resulted in the loss of 17% SLC25A46 interactions, including ER calcium homeostasis related proteins. Conclusively, dysregulation of key cell functions in the absence of SLC25A46, such as oxidative phosphorylation, mitochondrial architecture and dynamics, and calcium homeostasis, combined with the rich interaction network of SLC25A46, highlight its involvement in key pathophysiological mechanisms linking mitochondria to the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Overall, the results of this thesis demonstrate the important role of SLC25A46 in normal mitochondrial function, structure, and communication of mitochondria with other cellular organelles, contributing to better understanding of SLC25A46-induced neurological diseases.

Η μιτοχονδριακή πρωτεΐνη SLC25A46, μέλος της οικογένειας SLC25 των μιτοχονδριακών μεταφορέων, συσχετίστηκε πρόσφατα με ένα ευρύ φάσμα αυτοσωμικών υπολειπόμενων νευρολογικών παθήσεων, όπως οπτική ατροφία, περιφερική νευροπάθεια Charcot-Marie-Tooth τύπου 2, σύνδρομο Leigh, προοδευτική μυοκλωνική αταξία, παρεγκεφαλιδική αταξία και θανατηφόρα συγγενή παρεγκεφαλιδική υποπλασία. Ερευνητικά δεδομένα προτείνουν την συμμετοχή της SLC25A46 στη δυναμική κατάσταση των μιτοχονδρίων, στη διατήρηση της αρχιτεκτονικής των cristae της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης και στην επικοινωνία του μιτοχονδρίου με το ενδοπλασματικό δίκτυο. Ωστόσο, ο παθοφυσιολογικός ρόλος της πρωτεΐνης SLC25A46 παραμένει ακόμα ασαφής δυσχεραίνοντας την κατανόηση των εμπλεκόμενων παθογενετικών μηχανισμών. Η ερευνητική ομάδα της Δρ. Ελένης Ντούνη χρησιμοποιώντας την προσέγγιση της Πρόσθιας Γενετικής στο ποντίκι, αναγνώρισε μία μη νοηματική μετάλλαξη στο Slc25a46 γονίδιο που προκαλεί ένα αυτοσωμικό υπολειπόμενο νευρολογικό φαινότυπο στο ποντίκι (Slc25a46atc/atc) που προσομοιάζει τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών όπως αταξία, σπασμοί, ασταθή βάδιση, μυϊκή αδυναμία, οπτική ατροφία, υποπλασία της παρεγκεφαλίδας και καθυστερημένη ανάπτυξη με πρόωρη θνησιμότητα. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής, με σκοπό την περαιτέρω κατανόηση του παθοφυσιολογικού ρόλου της SLC25A46 πραγματοποιήθηκε: α) χαρακτηρισμός του σκελετικού συστήματος των Slc25a46atc/atc ποντικιών, β) ανάλυση της ενεργότητας των μιτοχονδρίων σε παρεγκεφαλίδα, εγκέφαλο, θύμο και σπλήνα Slc25a46atc/atc ποντικιών προκειμένου να ανιχνευθεί η επίδραση της έλλειψης της SLC25A46 πρωτεΐνης στη μιτοχονδριακή λειτουργία, γ) ανίχνευση απορυθμισμένων πρωτεϊνικών δικτύων και μονοπατιών τόσο στην παρεγκεφαλίδα Slc25a46atc/atc ποντικιών, όσο και σε κυτταρικό σύστημα επαγόμενης αποσιώπησης της SLC25A46 με πρωτεομική ανάλυση (LC-MS/MS) για την κατανόηση των εμπλεκόμενων παθογενετικών μηχανισμών, δ) δημιουργία και χαρακτηρισμός διαγονιδιακών ποντικιών που εκφράζουν την SLC25A46-FLAG πρωτεΐνη (TgSLC25A46-FLAG), ε) ταυτοποίηση των in vivo αλληλεπιδράσεων της SLC25A46 σε ιστούς TgSLC25A46-FLAG ποντικιών, μέσω ανοσοκατακρήμνισης με a-FLAG σφαιρίδια και ταυτοποίηση των συμπλόκων που περιέχουν την SLC25A46-FLAG με πρωτεομική ανάλυση (LC-MS/MS), στ) προσδιορισμός της επίδρασης μεταλλάξεων στο δίκτυο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων της SLC25A46 μέσω δημιουργίας ανασυνδυασμένων πλασμιδίων για μεταλλάξεις της SLC25A46, παροδική έκφρασής τους σε κύτταρα N2A, ανοσοκατακρήμνιση με a-FLAG σφαιρίδια και ταυτοποίηση των συμπλόκων με πρωτεομική ανάλυση (LC-MS/MS). Αρχικά, ιστολογική και ποσοτική ανάλυση με microCT του μηριαίου οστού σε Slc25a46atc/atc ποντίκια, έδειξε έντονη οστική απώλεια τόσο στο σπογγώδες οστό της μετάφυσης όσο και στο φλοιώδες οστό της διάφυσης. Επιπλέον, συγκριτική ανάλυση mRNA έκφρασης, σε μηριαία οστά Slc25a46atc/atc και WT ποντικιών, έδειξε αυξημένη έκφραση του γονιδίου RANKL που επάγει την οστεοκλαστογένεση και μειωμένη έκφραση του ALP που αποτελεί δείκτη της οστεοβλαστικής ενεργότητας, υποδεικνύοντας ότι πιθανώς υπάρχει αύξηση της οστεοκλαστογένεσης με μειωμένη οστική σύνθεση που θα μπορούσαν να προκαλέσουν οστική απώλεια. Ταυτόχρονα παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης γονιδίων που ανήκουν στο σύμπλοκο Ι της αναπνευστικής αλυσίδας, υποδεικνύοντας πιθανή σύνδεση του οστεοπορωτικού φαινοτύπου με τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία των Slc25a46atc/atc ποντικιών. Στη συνέχεια, μιτοχονδριακή ανάλυση στην παρεγκεφαλίδα των Slc25a46atc/atc ποντικιών έδειξε μειωμένα επίπεδα δραστικών μορφών οξυγόνου και υπερπόλωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης, ενώ η συγκέντρωση του ATP δεν παρουσίασε διαφορές. Έπειτα, συγκριτική πρωτεομική ανάλυση σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα παρεγκεφαλίδας Slc25a46atc/atc και WT ποντικιών, φανέρωσε σημαντική μείωση των πρωτεϊνών της αναπνευστικής αλυσίδας, κυρίως των συμπλόκων Ι, ΙΙΙ και ΙV, καθώς και αύξηση των πρωτεϊνών της μιτοχονδριακής δυναμικής και της οργάνωσης των cristae, υποδηλώνοντας αλλαγές στη δομή και τη βασική λειτουργία των μιτοχονδρίων. Επιπλέον, βρέθηκαν απορυθμισμένες διαδικασίες του κυτταρικού μεταβολισμού, της ομοιόστασης των λιπιδίων και του ασβεστίου, όπως επίσης και διαδικασίες νευρογένεσης και λειτουργίας των συνάψεων. Παράλληλα συγκριτική πρωτεομική ανάλυση σε κυτταρική σειρά επαγόμενης αποσιώπησης της SLC24A46, έδειξε ότι η απουσία της SLC25A46 επηρεάζει κυρίως την έκφραση πρωτεϊνών του πυρήνα, που σχετίζονται με διαδικασίες επεξεργασίας των νουκλεϊκών οξέων και της χρωματίνης, πρωτεϊνών της οργάνωσης του μιτοχονδρίου και της μιτοχονδριακής σύντηξης και πρωτεϊνών που σχετίζονται με τον μεταβολισμό και την παραγωγή ενέργειας στο μιτοχόνδριο. Για τη καλύτερη κατανόηση του φυσιολογικού ρόλου της SLC25A46 πρωτεΐνης, δημιουργήθηκαν και χαρακτηρίστηκαν διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν την πρωτεΐνη SLC25A46-FLAG (ΤgSLC25A46-FLAG) και ανιχνεύθηκε το δίκτυο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεών της SLC25A46 σε παρεγκεφαλίδα, εγκέφαλο, καρδιά και θύμο, χρησιμοποιώντας ανοσοκατακρήμνιση και πρωτεομική ανάλυση. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής επιβεβαίωσαν ήδη γνωστές αλληλεπιδράσεις της SLC25A46 με μέλη του συμπλόκου ΜICOS, ενώ έδειξαν για πρώτη φορά ότι αλληλεπιδρά με ένα μεγάλο δίκτυο πρωτεϊνών, όπως μέλη της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης και της F1F0-ATP συνθάσης, πρωτεΐνες των σημείων επαφής των μιτοχονδρίων και ενδοπλασματικού δικτύου και πρωτεΐνες των συναπτικών κυστιδίων. Τέλος, δημιουργήθηκαν ανασυνδυασμένα πλασμίδια για παρανοηματικές μεταλλάξεις του SLC25A46 γονιδίου που ανιχνεύθηκαν σε ασθενείς. Η χιμαιρική SLC25A46R257Q-FLAG πρωτεΐνη που παρουσίασε σταθερότητα στην έκφραση επιλέχθηκε για την εύρεση των αλληλεπιδράσεών της. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μετάλλαξη p.R257Q διατηρεί την πλειοψηφία (81%) των αλληλεπιδράσεων της SLC25A46, συμπεριλαμβανομένων γνωστών αλληλεπιδράσεων της SLC25A46 όπως η IMMT. Ωστόσο, σε σχέση με την αγρίου τύπου SLC25A46 η μετάλλαξη p.R257Q προκαλεί απώλεια του 17% των αλληλεπιδράσεών της, συμπεριλαμβάνοντας πρωτεΐνες που σχετίζονται με την ομοιόσταση του ασβεστίου στο ενδοπλασματικό δίκτυο.Συμπερασματικά, η απορρύθμιση βασικών λειτουργιών του κυττάρου απουσία της SLC25A46, όπως η οξειδωτική φωσφορυλίωση, η αρχιτεκτονική και δυναμική του μιτοχονδρίου και η ομοιόσταση του ασβεστίου, σε συνδυασμό με το πλούσιο δίκτυο αλληλεπιδράσεων της SLC25A46, αναδεικνύουν την εμπλοκή της σε βασικούς παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς που συνδέουν το μιτοχόνδριο με την παθογένεση νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Συνολικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής αναδεικνύουν το σημαντικό ρόλο της SLC25A46 στη φυσιολογική λειτουργία, τη δομή και την επικοινωνία των μιτοχονδρίων με άλλα κυτταρικά οργανίδια, συμβάλλοντας στην καλύτερη κατανόηση των SLC25A46-επαγόμενων νευρολογικών παθήσεων.