Ο ρόλος του γονιδίου Cyld στη διαφοροποίηση και λειτουργία μακροφάγων κυττάρων

Abstract

Many extra-and intra-cellular signal transducers dictate the diversity of innate immune reactivities underlying inflammatory reactions; these define the relevant cellular responses for infectious & damage control, immune regulation, and tissue regeneration. In the noisy intracellular environment, signal adaptation and specification are achieved via the post-translation addition of chemical groups on signaling proteins- and their differential removal. CYLD is a member of ubiquitin hydrolases (deubquitinases, DUBs) favoring the removal of long polymeric ubiquitin chains (poly-Ub), which are linked via ubiquitin lysine 63 (K63), or their aminoterminal methionines (M1). Current suppositions favor that CYLD acts as an anti-inflammatory molecule since it can remove M1- and K63-linked poly-Ub from signalers, activating the inflammatory transcription factor, NFκB; and from necrosome components, thus starting programmed necrosis. Still, these suppositions are based on disparate data from various tissue settings, whereas the data on the functions of CYLD on innate immune cells are limited. The main objective of the research presented herein was to clarify the functional roles of CYLD in innate immune reactivity and macrophage responses. To address this objective, we analyzed transgenic mice bearing a debilitating mutation on the CYLD gene in the myeloid lineage (which includes monocyte/macrophages) for their responses to infectious and inflammatory challenges. In agreement to previous suppositions for the anti-inflammatory functions of CYLD, its myeloid mutants displayed: (a) enhanced capabilities in clearing systemic infections from intracellular pathogens, as well as enteric inflections from extracellular enteropathogens, and (b) enhanced cell-mediated inflammation and tissue damage. Contrary to their response to bacterial infection, the same mice displayed partial resistance to cytokine storms elicited during septic inflammatory conditions; and enhanced capability to resolve chemically induced, chronic and tumor-supporting inflammation in the intestine more efficiently. The duality of CYLD’s functions was demonstrated further in ex-vivo macrophage cultures. Their analyses revealed that CYLD is required to properly activate classical pro-inflammatory macrophages elicited by the primary signals of Toll-like receptor 4 (TLR4). In the absence of CYLD’s functions, macrophages instead activate danger signals via inflammasomes that lead to the enhanced secretion of pyrogenic interleukin 1β (IL1β), altering the balance between pyroptosis and programmed necrosis. Moreover, the analyses revealed that the inability of CYLD mutant macrophages to acquire a classical pro-inflammatory phenotype properly did not relate to the downregulation of NFκB signaling. This suggested that CYLD may have added functions towards regulating epigenetic or post-transcriptional events. To gain insight into the latter, we created myeloid mutants with a combination of debilitating mutations in CYLD and a central, anti-inflammatory post-transcriptional control, the RNA-binding protein Elavl1/HuR. The analyses of the double mutants indicated the genetic antagonism of the two factors- both for the support of classical macrophage phenotypes and infectious inflammation. Collectively, our data demonstrate the importance of CYLD in supporting the specific activation of pro-inflammatory responses instead of the less selective responses to danger signals. Moreover, they suggest that in macrophages, CYLD’s activities extend beyond the regulation of NFκΒ signaling and towards post-transcriptional and/or epigenetic events. As such, the current conceptual framework on the role of CYLD-and relevant linear polyubiquitination modifications- in inflammation should be revisited.

Η ποικιλότητα των δράσεων της έμφυτης ανοσίας στις φλεγμονές καθορίζεται από το πλήθος των εξω- κι ενδο-κυτταρικών σηματοδοτών που διαμορφώνουν τις δράσεις των κυττάρων της -είτε προς εκκαθάριση λοιμωδών και τοξικών παραγόντων ή για ανοσορύθμιση και ιστική αναδόμηση. Στο θορυβώδες ενδοκυτταρικό περιβάλλον, η προσαρμογή και η εξειδίκευση των σηματοδοτήσεων επιτυγχάνεται μέσω της μετα-μεταφραστικής προσθήκης χημικών ομάδων σε πρωτεΐνες σηματοδότησης-και της διαφορικής αφαίρεσης αυτών. Η πρωτεΐνη CYLD αποτελεί μέλος μιας οικογένειας ενζύμων αφαίρεσης (DeUBquitinases, DUBs) γραμμικών πολυμερών ουβικουιτίνης (polyUb) που δημιουργούνται κυρίως μέσω ακολουθίας διασυνδέσεων λυσίνης στη θέση 63 (Κ63) ή αμινοτελικών μεθειονινών (M1). Τα polyUb εντοπίζονται σε πρωτεΐνες ενδοκυτταρικής σηματοδότησης και δρουν ως ικριώματα ενίσχυσης/εξειδίκευσης των σηματοδοτήσεων. Οι τρέχουσες θεωρήσεις υποστηρίζουν ότι η CYLD αποτελεί μόριο αντιφλεγμονώδους δράσης μέσω αφαίρεσης poly-UB (K63): (α) από σηματοδότες ενεργοποίησης του φλεγμονώδους μεταγραφικού παράγοντα NFκΒ, και (β) συστατικά του νεκροσώματος με αποτέλεσμα την προαγωγής προγραμματισμένης νέκρωσης. Παρά ταύτα, οι θεωρήσεις αυτές βασίζονται στο συνδυασμό δεδομένων από διάφορα ιστικά περιβάλλοντα, ενώ τα δεδομένα σχετικά με τις δράσεις της CYLD στα κύτταρα της έμφυτης ανοσίας είναι περιορισμένα. Αντικείμενο έρευνας της παρούσης διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η ανάλυση του λειτουργικού ρόλου της CYLD στις αποκρίσεις της έμφυτης ανοσίας και των μακροφάγων κυττάρων. Για το σκοπό αυτό, μύες πού έφεραν μετάλλαγμα απώλειας των λειτουργειών της CYLD σε κύτταρα της μυελικής σειράς-και κατ’επεκτασην σε μονοκύτταρα/μακροφάγα- αναλύθηκαν ως προς τις αποκρίσεις τους έναντι λοιμωδών και φλεγμονωδών προκλήσεων. Σε συμφωνία με τις υπάρχουσες θεωρήσεις για την αντιφλεγμονώδη δράση της CYLD, oι μύες που έφεραν τη μυελική μετάλλαξη του γονιδίου της, επέδειξαν: (α) ενισχυμένες ικανότητες εκκαθάρισης συστηματικών λοιμώξεων από ενδοκυτταρικά βακτηριακά παθογόνα, και γαστρεντερικών λοιμώξεων από εξωκυτταρικά εντεροπαθογόνα, και (β) την ενίσχυση κυτταρομεσολαβούμενης φλεγμονής και ιστικής βλάβης. Αντίθετα όμως με την ανταπόκριση τους στις βακτηριακές λοιμώξεις, οι ίδιοι μύες, εμφάνισαν ανθεκτικότητα σε σηπτικές προφλεγμονώδεις προκλήσεις που βασίζονται σε ακολουθίες κυτοκινών μετά τις λοιμώξεις. Παράλληλα, παρουσίασαν ενισχυμένη ικανότητα καταστολής χημικά επαγόμενων, χρόνιων και ογκογόνων εντερικών φλεγμονών.Ο διττός ρόλος της CYLD αποκαλύφθηκε από την ανάλυση μακροφάγων ex-vivo. Η ανάλυση αυτή έδειξε ότι η CYLD είναι απαραίτητη για την ορθή ενεργοποίηση των κλασσικών προ-φλεγμονώδων μακροφάγων από πρωτογενή σήματα του υποδοχέα αναγνώρισης προτύπων Toll-like receptor 4 (TLR4). Απουσία των δράσεων της CYLD, τα μακροφάγα ενεργοποιούν σηματοδοτήσεις κινδύνου μέσω φλεγμονοσωμάτων που καθοδηγούν την υπερ-έκκριση της πυρογόνου ιντερλευκίνης 1β (IL-1β) και την ενδεχόμενη αλλαγή του ισοζυγίου προγραμματισμένης νέκρωσης έναντι πυρόπτωσης. Από τις αναλύσεις αυτές προέκυψε ότι η αδυναμία ανάκτησης του κλασσικού προφλεγμονώδους φαινοτύπου των μακροφάγων που υπολείπονται των δράσεων της CYLD δεν σχετίζεται με τη μειορύθμιση της σηματοδοτόσης του NFκΒ. Αυτό υποδεικνύει την ενδεχόμενη δράση της CYLD στην ενεργοποίηση επιγενετικών ή μετα-μεταγραφικών ρυθμιστών. Ως προς διερεύνηση του τελευταίου, δημιουργήθηκαν μυελικά μεταλλάγματα ταυτόχρονης απενεργοποίησης της CYLD και ενός αντι-φλεγμονώδους μετα-μεταγραφικού ρυθμιστή -της ριβονουκλεοπρωτεϊνης Elavl1/HuR. Η πρώτη ανάλυση αυτών των διπλών μεταλλαγμάτων υπέδειξε το γενετικό ανταγωνισμό των δύο παραγόντων-τόσο ως προς την υποστήριξη του προφλεγμονώδους φαινότυπου των μακροφάγων, όσο και προς το φλεγμονώδη εκφυλισμό που έπεται των βακτηριακών λοιμώξεων. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα μας αναδυκνείουν την CYLD ως καθοριστική για την ειδίκευση των προφλεγμονωδών δράσεων της έμφυτης ανοσίας έναντι των λιγότερο ειδικών αντιδράσεων κινδύνου. Επιπρόσθετα, υποδεικνύουν ότι στα μακροφάγα, οι δράσεις τις CYLD επεκτείνονται πέραν της ρύθμισης του μεταγραφικού παράγοντα NFκΒ, και προς της ρύθμιση μετα-μεταγραφικών ή/και επιγενετικών δικτύων. Ως εκ τούτου, οι τρέχουσες θεωρήσεις για τις δράσεις της CYLD-αλλά και των γραμμικών πολυμερών ουβικουιτίνης- χρήζουν αναθεώρησης.