Διερεύνηση μέτα-μεταγραφικών μηχανισμών που εμπλέκονται στις παθοφυσιολογικές διεργασίες του νευρικού συστήματος με έμφαση στον νευροεκφυλισμό

Abstract

Αlpha-synuclein (SNCA) has been associated with the central nervous system, is localized mainly in the presynaptic terminals of neurons and is thought to be important for synaptic plasticity, vesicular packaging and trafficking. Although its function has not been fully elucidated, it is thought to regulate the amount of synaptic vesicles that bind to the synapse during neurotransmitter release. Abnormal expression of SNCA is a fundamental feature in several diseases including Parkinson's disease (PD), Lewy body dementia and Multiple system atrophy, with a critical role in the initiation and exacerbation of neurodegeneration. Understanding the mechanisms underlying SNCA expression is essential for the development of potential therapeutic interventions. Research activity to date has focused on the processes of misfolding and protein accumulation with little attention paid to the regulatory networks that shape the fate of the α-synuclein messenger RNA (mRNA). Studies have reported SNPs in the 3' untranslated region (3'UTR) of α-synuclein mRNA and changes in its length distribution in PD patients compared to healthy individuals. The 3'UTR of α-synuclein, through the mechanism of alternative polyadenylation, can produce mRNAs of many different lengths. In particular, 3'UTRs with lengths of 290, 480, 560, 1070 and 2520 nuleotides have been identified. RNA-binding proteins (RBPs) contribute to a plethora of functions in the mRNA life cycle from splicing and alternative polyadenylation to nucleocytoplasmic shuttling and further to subcellular localization, stability, granule stress dynamics and even translation levels. The aim of this study was to map the points in the life cycle of α-synuclein mRNA at which regulatory control is exerted by two such proteins, AUF1 (AU-binding Factor 1) and hnRNPA1 (heterogeneous ribonucleoprotein A1).Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D (hNRNPD), also known as AU-binding factor 1 (AUF1), comprises four protein isoforms (p37, p40, p42 and p45) capable of moving between the nucleus and the cytoplasm. AUF1 binds U-, GU- and UG-rich sequences and is involved in many processes such as transcriptional activation and alternative splicing and either promotes degradation or enhances the stability and translation of target mRNAs by mechanisms that are yet poorly understood. AUF1 protein was precipitated using biotinylated SNCA mRNA segments (5'UTR, coding region, proximal 3'UTR, distal 3'UTR) where it was found bound to the 3'UTR segments and absent from the other functional regions of the mRNA. Upregulated AUF1 was able to reduce SNCA mRNA levels leaving the levels of the long 3'UTR isoform consisting of 2520 bases (3'UTR2520) unaffected. The decrease in total mRNA levels coincided with destabilization of the short mRNA isoforms and a shortening of their average poly(A) tail length. The length of the poly(A) tail is a determinant of the lifetime of an mRNA molecule, with its shortening signaling destruction processes. Further biotinylated RNA precipitation and co-immunoprecipitation experiments showed that AUF1 recruits the CNOT1-CNOT7 deadenylation complex to the α-synuclein mRNA. Finally, it prevents SNCA mRNA-ribosome binding, leading to an overall 35% reduction in α-synuclein protein levels. On the other hand, reduction of AUF1 levels resulted in a 35% decrease in α-synuclein levels, a surprising fact as it elevated the total α-synuclein mRNA levels, as well as the 3'UTR2520 isoform. Additionally, it increased the stability of the short mRNA of α-synuclein and increased the average length of the poly(A) tail. A possible explanation for the inhibition of α-synuclein protein synthesis in the absence of AUF1 is the strong retention of both short and long mRNA isoforms of α-synuclein in the nucleus. Given the strong nuclear presence of AUF1 it seems important for the 'healthy' exit of α-synuclein mRNA from the nucleus. Finally, given the literature-known interaction of AUF1 with miRNAs, the interaction of AUF1 with the strong negative regulators of α-synuclein mRNA miRNA-7 and miRNA-153 was tested. Manipulation of AUF1 levels left the levels of miRNAs unaffected and did not appear to participate in feedback loops in inhibiting α-synuclein expression. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (hnRNPA1) is an evolutionarily conserved and highly expressed protein involved in a variety of RNA processing events, including transcription, telomere maintenance, miRNA splicing, mRNA stability and translation. It has been associated with neurodegenerative diseases such as Amyotrophic Lateral Sclerosis and Multisystem proteinopathy. Similarly to AUF1, hnRNPA1 binds to both the proximal and distal 3'UTR without showing affinity to the 5'UTR and the SNCA mRNA coding region, indicating that it can exert control over all 3'UTR isoforms. The knowledge that hnRNPA1 is involved in the exit of certain target mRNAs from the nucleus led us to investigate its influence on the subcellular localization of α-synuclein mRNA, where it led to a prolonged persistence of the 3'UTR2520 isoform in the nucleus (with hnRNPA1 silencing leading to increased mRNA exit from the nucleus). Furthermore, in a catecholaminergic cell model, it was found to be able to alter the cytoplasmic localization of mRNA favoring the persistence of more elongated isoforms in the soma relative to the outgrowth, an observation which was paralleled in protein levels. Given the toxic effect of excessive α-synuclein on neurons, the function of hnRNPA1 as a regulator of mRNA and α-synuclein protein localization suggests its potential importance in α-synuclein-mediated neurodegeneration. The hnRNPA1 appeared to be a regulator of alternative polyadenylation (APA), with its overexpression leading to a 45% increase in the long isoform-to-total ratio. Three possible mechanisms underlying the APA of α-synuclein were examined, interference with the 3' end processing factors, cooperation with the U1 spliceosome component and finally enhancement of transcription elongation factors by promoting the binding of phosphorylated-TEFb to RNA polymerase II (Pol II), which seemed to be the most likely mechanism. Differential control of α-synuclein mRNA isoforms by hnRNPA1 is also identified in the case of mRNA stability with hnRNPA1 leading to destabilization of short isoforms, with a mechanism so far unknown. It appears independent of regulation via miRNA-7 and miRNA-153, presumably occurring with involvement of the CNOT1-CNOT7 complex as hnRNPA1 induced deadenylation but no direct interaction with the complex has been found. hnRNPA1 has been identified as a regulator of protein degradation and recycling processes. Therefore, its effect on these processes was studied in the SK-N-SH neuroblastoma cell model, where it was found to enhance proteasome activity, catabolism of ubiquitinylated proteins and positively affect autophagic flux with its silencing being associated with a slowing down of protein degradation mechanisms. The direct reduction of SNCA mRNA-ribosome affinity was examined and shown not to be a point of regulation. The sum of the above components was a decrease in protein α-synuclein levels in the presence of hnRNPA1 and an increase in the absence of hnRNPA1.In conclusion, the investigation of the mechanisms involved in the control of SNCA through its 3'UTR by AUF1/hnRNPA1 revealed two important pre-translational regulators of SNCA and highlighted the importance of alternative polyadenylation in the orderly production and presence of α-synuclein. Mapping the interactions of RBPs with their target mRNAs is important for understanding the mechanisms underlying transcript regulation, health/pathogenesis balance and thus adding to the human 'toolbox' for the development of novel therapeutic approaches.

Η πρωτεΐνη α-συνουκλεΐνη (SNCA) έχει συσχετιστεί κυρίως με το κεντρικό νευρικό σύστημα, εντοπίζεται κυρίως στις προσυναπτικές απολήξεις των νευρώνων και θεωρείται σημαντική για τη συναπτική πλαστικότητα και την κυψελιδική συσκευασία και διακίνηση. Αν και η λειτουργία της δεν έχει αποσαφηνισθεί πλήρως, πιστεύεται ότι ρυθμίζει την ποσότητα των συναπτικών κυστίτιδων που προσδένονται στη σύναψη κατά την απελευθέρωση νευροδιαβιβαστών. Μη φυσιολογική έκφραση της SNCA αποτελεί θεμελιώδες χαρακτηριστικό σε μια σειρά νόσων μεταξύ των οποίων της νόσου του Πάρκινσον (νΠ), της άνοιας με σωμάτια Lewy και της ατροφίας πολλαπλών συστημάτων, με κρίσιμο ρόλο στην έναρξη και επιδείνωση του νευροεκφυλισμού. Η κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν την έκφραση της SNCA είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη πιθανών θεραπευτικών παρεμβάσεων. Η ερευνητική δραστηριότητα έως τώρα έχει επικεντρωθεί στις διεργασίες λανθασμένης αναδίπλωσης και συσσώρευσης της πρωτεΐνης με μικρή προσοχή να έχει δοθεί στα ρυθμιστικά δίκτυα που διαμορφώνουν το πεπρωμένο του αγγελιοφόρου RNA (mRNA) της α-συνουκλεΐνης. Μελέτες έχουν αναφέρει μεταλλάξεις στο 3’ αμετάφραστο άκρο (3’UTR) του mRNA της α-συνουκλεΐνης νΠ και αλλαγές στην κατανομή μήκους του σε ασθενείς με νΠ σε σχέση με υγιή άτομα .Το 3’ αμετάφραστο άκρο της α-συνουκλεΐνης μέσα από το μηχανισμό της εναλλακτικής πολυαδενυλίωσης είναι ικανό να παράγει πολλά διαφορετικά μήκη στο τελικό mRNA. Πιο συγκεκριμένα έχουν αναγνωριστεί 3’UTR με μήκη 290, 480, 560, 1070 και 2520 βάσεων.Οι πρωτεΐνες δέσμευσης RNA (RNA-binding proteins, RBPs) συμβάλουν σε πληθώρα λειτουργειών στον κύκλο ζωής του mRNA, από το μάτισμα και την εναλλακτική πολυαδενυλίωση, στην μεταφορά του mRNA εκτός του πυρήνα και περαιτέρω στην τοποθέτηση στο κύτταρο, την σταθερότητα την δυναμική κοκκίων στρες, ακόμη και τα επίπεδα μετάφρασης. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν χαρτογράφηση των σημείων στον κύκλο ζωής του mRNA της α-συνουκλεΐνης στα οποία ασκείται ρυθμιστικός έλεγχος από δυο τέτοιες πρωτεΐνες, την AUF1 (ΑU-binding Factor 1) και hnRNPA1 (heterogenous ribonucleoprotein A1).Η ετερογενής πυρηνική ριβονουκλεοπρωτεΐνη D (HNRNPD), επίσης γνωστή ως παράγοντας δέσμευσης AU 1 (AUF1), περιλαμβάνει τέσσερις πρωτεϊνικές ισομορφές (p37, p40, p42 και p45) ικανές να μετακινούνται μεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος. Η AUF1 δεσμεύει αλληλουχίες πλούσιες σε U, GU και UG και συμμετέχει σε πολλές διεργασίες όπως η μεταγραφική ενεργοποίηση και η εναλλακτική ωρίμανση και είτε προάγει την αποσύνθεση είτε ενισχύει τη σταθερότητα και τη μετάφραση των mRNA-στόχων με μηχανισμούς που είναι ακόμη ελάχιστα κατανοητοί. Η πρωτεΐνη AUF1 κατακρημνίστηκε με χρήση βιοτινυλιωμένων τμημάτων του SNCA mRNA (5’UTR, κωδικεύουσα περιοχή, βραχύ 3’UTR, άπω 3’UTR) όπου βρέθηκε προδεδεμένο στα τμήματα 3’UTR και απών από τις άλλες λειτουργικές περιοχές του mRNA. Στην περίπτωση της ανεβασμένης παρουσίας AUF1, βρέθηκε ικανή να μειώσει τα επίπεδα SNCA mRNA αφήνοντας ανεπηρέαστα τα επίπεδα της μακριάς ισομορφής 3’UTR αποτελούμενη από 2520 βάσεις (3’UTR2520). Η μείωση των συνολικών επιπέδων συνέπεσε με αποσταθεροποίηση των βραχέων ισομορφών του mRNA και μείωση του μέσου μήκους της πολύ(Α) ουράς τους. Το μήκος της πολύ(Α) ουράς αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για το χρόνο ζωής ενός μορίου mRNA, με τη βράχυνση της να σηματοδοτεί διαδικασίες καταστροφής του. Περαιτέρω πειράματα κατακρήμνισης με βιοτινυλιωμένο RNA και συν-ανοσοκατακρήμνισης έδειξαν πως η AUF1 στρατολογεί το σύμπλοκο αποαδενυλίωσης CNOT1-CNOT7 στο mRNA της α-συνουκλεΐνης. Τέλος, αποτρέπει την πρόσδεση SNCA mRNA – ριβοσώματος, οδηγώντας συνολικά σε μείωση των πρωτεϊνικών επιπέδων α-συνουκλεΐνης κατά 35%. Από την άλλη πλευρά, η μείωση των επιπέδων AUF1 επέφερε μείωση των επιπέδων α-συνουκλεΐνης της τάξης του 35%, δεδομένο που ξάφνιασε καθώς ανέβασε τα συνολικά επίπεδα mRNA της α-συνουκλεΐνης, όπως και της ισομορφής 3’UTR2520. Όχι μόνον αυτό, αλλά πρόσδωσε σταθερότητα στο βραχύ mRNA της α-συνουκλεΐνης και αύξησε το μέσο μήκος της πολύ(Α) ουράς. Πιθανή εξήγηση για την παρακώλυση της πρωτεϊνοσύνθεσης α-συνουκλεΐνης απουσία AUF1 αποτελεί η εντονότατη συγκράτηση τόσο των βραχέων όσο και των επιμηκών ισομορφών mRNA της α-συνουκλεΐνης στον πυρήνα. Δεδομένης της έντονης πυρηνικής παρουσίας της AUF1 φαίνεται σημαντική για την ‘υγιή’ έξοδο των mRNA της α-συνουκλεΐνης από τον πυρήνα. Τέλος, δεδομένης της βιβλιογραφικά γνωστής αλληλεπίδρασης της AUF1 με τα miRNA ελέγχθηκε η αλληλεπίδραση της AUF1 με τους ισχυρούς αρνητικούς ρυθμιστές του mRNA της α-συνουκλεΐνης miRNA-7 και miRNA-153. Χειραγώγηση των επιπέδων AUF1 άφησε ανεπηρέαστα τα επίπεδα των miRNAs και δεν έδειξε να συμμετέχει σε ανατροφοδοτικό κύκλο με αυτά στην αναστολή της έκφρασης α-συνουκλεΐνης.Η ετερογενής πυρηνική ριβονουκλεοπρωτεΐνη Α1 (hnRNPA1) είναι μια εξελικτικά συντηρημένη και υψηλά εκφραζόμενη πρωτεΐνη που εμπλέκεται σε ποικίλα γεγονότα επεξεργασίας RNA, συμπεριλαμβανομένης της μεταγραφής, της διατήρησης των τελομερών, της ωρίμανσης των miRNA, της σταθερότητας του mRNA και της μετάφρασης. Έχει συσχετιστεί με νευροεκφυλιστικές ασθένειες όπως η αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση και η πολυσυστηματική πρωτεϊνοπάθεια. Ομοίως με την AUF1 η hnRNPA1 προσδένεται τόσο στο εγγύς όσο και στο άπω 3’UTR χωρίς να παρουσιάζει συγγένεια με τα 5’UTR και την κωδική περιοχή του SNCA mRNA, υποδεικνύοντας πως δύναται να ασκήσει έλεγχο σε όλες τις ισομορφές 3’UTR. Η βιβλιογραφική γνώση πως η hnRNPA1 συμμετέχει στην έξοδο ορισμένων mRNA στόχων από τον πυρήνα μας οδήγησε στη διερεύνηση της επιρροής της στην υποκυτταρική τοποθέτηση του mRNA της α-συνουκλεΐνης, όπου και οδήγησε σε παρατεταμένη παραμονή της 3’UTR2520 ισομορφής στον πυρήνα (με την αποσιώπηση hnRNPA1 να οδηγεί σε αυξημένη έξοδο του mRNA από αυτόν). Επιπλέον, σε μοντέλο κατεχολαμινεργικών κυττάρων βρέθηκε ικανό να μεταβάλει την κυτταροπλασματική τοποθέτηση του mRNA ευνοώντας την παραμονή των πιο επιμήκων ισομορφών στο σώμα σε σχέση με την τους νευράξονες, γεγονός που είχε αντίκτυπο και στα επίπεδα πρωτεΐνης. Δεδομένης της τοξικής επίδρασης της υπερβολικής α-συνουκλεΐνης στους νευρώνες, η λειτουργία της hnRNPA1 ως ρυθμιστής της τοποθέτησης του mRNA και της πρωτεΐνης α-συνουκλεΐνης υποδεικνύει την ενδεχόμενη σημαντικότητά της στον νευροεκφυλισμό διαμεσολαβούμενο από α-συνουκλεΐνη.Η hnRNPA1 φάνηκε ρυθμιστής της εναλλακτικής πολυαδενυλίωσης (ΕΠΑ), με την υπερέκφρασή του να οδηγεί σε αύξηση της αναλογίας της μακριάς ισομοφής δια του συνόλου κατά 45%. Εξετάστηκαν τρεις πιθανοί μηχανισμοί που διέπουν την ΕΠΑ της α-συνουκλεΐνης, η παρεμβολή στους παράγοντες της επεξεργασίας του 3’ άκρου, η συνεργασία με το συστατικό του συναρμοσώματος U1 και τέλος η ενίσχυση των παραγόντων επιμήκυνσης της μεταγραφής μέσω της προώθησης της πρόσδεσης του φωσφορυλιωμένης-TEFb στην RNA πολυμεράση ΙΙ, το ένζυμο που συντελεί τη μεταγραφή (Pol II), μηχανισμός ο οποίος φάνηκε να είναι ο πιο πιθανός. Ο διαφορικός έλεγχος των ισομορφών του mRNA της α-συνουκλεΐνης από την hnRNPA1 αναγνωρίζεται και στο επίπεδο σταθερότητας του mRNA με την hnRNPA1 να οδηγεί σε αποσταθεροποίηση των βραχέων ισομορφών, με μηχανισμό άγνωστο έως τώρα. Φαίνεται ανεξάρτητη της ρύθμισης μέσω των miRNA-7 και miRNA-153, πιθανολογείται πως συντελείται με εμπλοκή του συμπλόκου CNOΤ1-CΝΟΤ7 καθώς η hnRNPA1 επέφερε αποαδενυλίωση χωρίς όμως να έχει βρεθεί άμεση αλληλεπίδραση με το σύμπλοκο. Η hnRNPA1 έχει αναγνωριστεί ως ρυθμιστής των διαδικασιών αποδόμησης και ανακύκλωσης πρωτεϊνών. Επομένως, μελετήθηκε η επίδραση της στις παραπάνω διαδικασίες στο κυτταρικό μοντέλο νευροβλαστικών κυττάρων SK-N-SH, όπου βρέθηκε να ενισχύει την ενεργότητα του πρωτεασώματος, τον καταβολισμό των ουβικουιτινιλιωμένων πρωτεϊνών και να επιδρά θετικά στην αυτοφαγική ροή με την αποσιώπηση της να συνεπάγεται με επιβράδυνση των μηχανισμών πρωτεϊνικής καταστροφής. Η άμεση μείωση της συγγένειας SNCA mRNA - ριβοσώματος εξετάστηκε και φάνηκε πως δεν αποτελεί σημείο ρύθμισης. Άθροισμα των παραπάνω συνισταμένων ήταν η πτώση των πρωτεϊνικών επιπέδων α-συνουκλεΐνης παρουσία hnRNPA1 και αύξησή τους απουσία hnRNPA1.Εν κατακλείδι, η διερεύνηση των μηχανισμών εμπλεκομένων στον έλεγχο της SNCA μέσα από το 3’UTR της από τις AUF1 / hnRNPA1 αποκάλυψε δυο σημαντικούς προμεταφραστικούς ρυθμιστές της και τόνισε την σημασία της εναλλακτικής πολυαδενυλίωσης στην εύρυθμη παραγωγή και παρουσία α-συνουκλεΐνης. Η χαρτογράφηση των αλληλεπιδράσεων των RBP με τα mRNA στόχους τους είναι σημαντική για την κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν τη ρύθμιση μεταγράφων, την ισορροπία υγείας/παθογένειας και κατ’ επέκταση προσθέτουν στην ανθρώπινη ‘εργαλειοθήκη’ για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων.