Κατασκευή εξειδικευμένων βακτηριακών στελεχών που επιτυγχάνουν την παραγωγή ανασυνδυασμένων μεμβρανοπρωτεϊνών σε υψηλές αποδόσεις

Abstract

Membrane proteins (MPs) are major structural and functional components of cell membranes in all living organisms, where they perform numerous important functions, such as maintenance of structural integrity, signaling or transport of nutrients, ions, and small molecules. Their crucial role is highlighted by the fact that they are encoded by 20-30 % of genes, both within prokaryotes and eukaryotes, while their proper folding and function are involved in a wide variety of diseases such as Alzheimer’s disease, cystic fibrosis, or cancer. Due to their multiple and important functions MPs are high-priority targets for drug development, and up to now, more than half of all known pharmaceuticals target such proteins. The detailed understanding of both MP structure and function requires the availability of significant amounts of isolated protein of high quality, to perform all the necessary structural and biochemical studies. Since MP natural abundance is usually very low, the amounts needed are typically obtained through recombinant overexpression in heterologous host. Escherichia coli is one of the most widely utilized host-organisms for the recombinant production of soluble and membrane proteins. Bacterial MP production, however, is usually accompanied by severe toxicity and low-level volumetric accumulation leading to low levels of final biomass and reduced accumulation of recombinant MPs in the cell membrane. Towards this direction, a bacterial strain, termed SuptoxR, was previously constructed. In this strain, co-expression of RraA, an inhibitor of the mRNA degrading activity of E. coli RNase E, can efficiently suppress the MP-induced toxicity, and simultaneously significantly enhance the cellular accumulation of membrane-incorporated recombinant MPs. Based on SuptoxR, a series of novel bacterial strains with further improved properties were developed, following two different strategies. In the first part, naturally occurring variants of RraA were searched within genomes of proteobacteria and plant chloroplasts. The selected variants were evaluated for their toxicity-suppressing and MP production-promoting effects, compared to the original E. coli RraA of SuptoxR. It was found that a number of these homologous RraA proteins also suppressed MP-induced cytotoxicity and enhanced the accumulation of MPs, and more importantly, co-expression of the RraAs from Proteus mirabilis and Providencia stuartii, frequently outperformed the MP-enhancing capabilities of E. coli SuptoxR. Thus, two second-generation E. coli SuptoxR strains were developed, termed SuptoxR2.1 and SuptoxR2.2, that overexpress the RraAs from P. mirabilis and P. stuartii, respectively. These new strains often achieved even further increased accumulation of well-folded, recombinant MPs compared to the original SuptoxR strain. The second part involved the evaluation of a set of previously generated E. coli strains that carry specific deletions in parts of the C-terminal domain of RNase E and exhibit reduced ribonucleolytic activity, for their ability to suppress the toxicity which is caused by MP-overexpression process and to enhance recombinant MP-productivity, in a manner resembling the conditions of RraA overexpression in E. coli SuptoxR. Some of these strains that encoded specific RNase E truncation variants, resulted in significantly enhanced levels of recombinant MP production. Among these, the E. coli strain expressing RneΔ22 mutation, suppressed efficiently the MP-induced cytotoxicity and achieved greatly enhanced levels of recombinant MP production of both prokaryotic and eukaryotic origin, while it also performed better than the commercially available bacterial strains, which are frequently utilized for recombinant MP production. This specific strain, in analogy to the original SuptoxR, termed SuptoxRNE22. Overall, the new strains presented here may become broadly applicable biotechnological tools for the production of recombinant MPs in bacteria, as their use enables the production of recombinant MPs of high quality and quantity, suitable for functional and structural studies.

Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες αποτελούν βασικά συστατικά που εντοπίζονται στις βιολογικές μεμβράνες όλων των ζωντανών οργανισμών. Συμμετέχουν σε μια πληθώρα κυτταρικών διεργασιών ζωτικής σημασίας, όπως για παράδειγμα στην μεταγωγή σημάτων, στην διατήρηση της ακεραιότητας της μεμβράνης ή στην μεταφορά θρεπτικών στοιχείων, ιόντων και άλλων μορίων διαμέσου της αυτής. Η σημασία τους υπογραμμίζεται επιπλέον από το γεγονός ότι κωδικοποιούνται από το 20-30 % του συνόλου των γονιδίων κάθε οργανισμού, ενώ η διαταραχή της σωστής αναδίπλωσης και της εύρυθμης λειτουργίας τους εμπλέκεται σε ένα πλήθος σοβαρών ασθενειών, όπως η νόσος Αλτσχάιμερ, η κυστική ίνωση ή ο καρκίνος. Λόγω των πολλαπλών και σημαντικών λειτουργιών τους, οι μεμβρανικές πρωτεΐνες αποτελούν στόχο για το σχεδιασμό και την ανάπτυξη θεραπευτικών μορίων, ενώ μέχρι στιγμής περισσότερες από τις μισές φαρμακευτικές ουσίες που κυκλοφορούν στην αγορά στοχεύουν σε έναν τέτοιο πρωτεϊνικό παράγοντα. Η πλήρης κατανόηση τόσο της δομής όσο και της λειτουργίας των μεμβρανικών πρωτεϊνών προϋποθέτει την διαθεσιμότητα μεγάλων ποσοτήτων απομονωμένων πρωτεϊνών καλής ποιότητας, για την διεξαγωγή όλων των απαραίτητων δομικών και βιοχημικών μελετών. Δεδομένου ότι οι ποσότητες των μεμβρανικών πρωτεϊνών που απαντώνται εγγενώς στα φυσικά κύτταρα είναι κατά κανόνα εξαιρετικά χαμηλές, είθισται οι πρωτεΐνες να απομονώνονται μετά από υπερέκφραση σε ετερόλογους οργανισμούς-ξενιστές. Το βακτήριο Escherichia coli αποτελεί έναν από τους ιστορικά προτιμώμενους οργανισμούς-ξενιστές για την παραγωγή ανασυνδυασμένων υδατοδιαλυτών και μεμβρανικών πρωτεϊνών. Ωστόσο, η βακτηριακή υπερέκφραση μεμβρανοπρωτεϊνών συνοδεύεται συχνά από φαινόμενα έντονης τοξικότητας και χαμηλής παραγωγικότητας που οδηγούν σε χαμηλά επίπεδα τελικής βιομάζας και μειωμένη συσσώρευση ανασυνδυασμένων μεμβρανικών πρωτεϊνών. Σε αυτή την κατεύθυνση, στο παρελθόν κατασκευάστηκε ένα βακτηριακό στέλεχος, το SuptoxR, το οποίο υπερεκφράζει την RraA, μια πρωτεΐνη-αναστολέα της αποδομητικής δράσης της RNάσης Ε του Ε. coli, και ανθίσταται στην κυτταροτοξικότητα που προκαλεί η υπερπαραγωγή μεμβρανικών πρωτεϊνών, ενώ ταυτόχρονα παράγει σημαντικά αυξημένες ποσότητες ανασυνδυασμένων μεμβρανικών πρωτεϊνών προκαρυωτικής και ευκαρυωτικής προέλευσης. Στην παρούσα ερευνητική εργασία, κατασκευάστηκε μια σειρά νέων βακτηριακών στελεχών με βάση το SuptoxR.Αρχικά, αναζητήθηκαν φυσικές παραλλαγές της RraA που εκφράζονται στα γονιδιώματα πρωτεοβακτηρίων και σε χλωροπλάστες φυτών και οι οποίες παρουσιάζουν παρόμοιες ή βελτιωμένες ιδιότητες σε σχέση με αυτές της E. coli RraA που υπερεκφράζεται στο στέλεχος SuptoxR. Οι επιλεγμένες παραλλαγές αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητά τους να αυξάνουν τα τελικά επίπεδα συσσώρευσης βιομάζας και ανασυνδυασμένων μεμβρανικών πρωτεϊνών στις βακτηριακές μεμβράνες. Βρέθηκε ότι εκτός από την αρχική RraA του E. coli, υπάρχει ένα πλήθος ομόλογων RraA πρωτεϊνών οι οποίες είναι εξίσου αποτελεσματικές στην προώθηση της υπερέκφρασης μεμβρανικών πρωτεϊνών. Επιπλέον, δύο εξ’ αυτών, οι RraA από τους οργανισμούς Proteus mirabilis και Providencia stuartii βρέθηκαν ότι ξεπερνούν σε αποδόσεις την E. coli RraA του SuptoxR. Έτσι, αναπτύχθηκαν δύο νέα βακτηριακά στελέχη δεύτερης γενιάς, τα SuptoxR2.1 και SuptoxR2.2, τα οποία μπορούν και καταπολεμούν την τοξικότητα που επάγεται από την υπερέκφραση μεμβρανικών πρωτεϊνών ενώ ταυτόχρονα παράγουν μεγάλες ποσότητες σωστά αναδιπλωμένων και λειτουργικών μεμβρανικών πρωτεϊνών που έχουν εισαχθεί στην βακτηριακή μεμβράνη. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε το κατά πόσο βακτηριακά στελέχη που εκφράζουν παραλλαγές της RNάσης Ε, από την οποία έχουν απαλειφθεί τμήματα της C-τελικής της περιοχής και έχουν μειωμένη ριβονουκλεολυτική ικανότητα, μπορούν επίσης να ενισχύσουν την υπερέκφραση μεμβρανικών πρωτεϊνών σε σύγκριση με κύτταρα που εκφράζουν την αγρίου τύπου ενδονουκλεάση, με τρόπο που προσομοιάζει τις συνθήκες υπερέκφρασης του αναστολέα της, της RraA. Ορισμένα από τα στελέχη που μελετήθηκαν και εξέφραζαν συγκεκριμένες γενετικές απαλοιφές, αύξησαν σημαντικά την απόδοση της υπερέκφρασης ανασυνδυασμένων μεμβρανοπρωτεϊνών, ενώ το βακτηριακό στέλεχος που έφερε την συγκεκριμένη μεταλλαγή RneΔ22, βρέθηκε ότι είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικό καθώς αυξάνει σημαντικά τα τελικά επίπεδα ανάπτυξης της καλλιέργειας και ταυτόχρονα ενισχύει τη συσσώρευση ενός εύρους ανασυνδυασμένων μεμβρανικών πρωτεϊνών προκαρυωτικής και ευκαρυωτικής προέλευσης, ξεπερνώντας σε αποδόσεις τα εμπορικά διαθέσιμα στελέχη που χρησιμοποιούνται κατά κύριο λόγο για την παραγωγή τέτοιων πρωτεϊνών. Σύμφωνα με αυτά τα δεδομένα, και σε αναλογία με το αρχικό E. coli στέλεχος SuptoxR, το στέλεχος που εκφράζει τη συγκεκριμένη παραλλαγή της RNάσης Ε, ονομάστηκε SuptoxRNE22. Συνολικά, τα τρία νέα στελέχη που παρουσιάζονται στην παρούσα μελέτη μπορούν να αποτελέσουν βιοτεχνολογικά εργαλεία ευρείας εφαρμογής για την παραγωγή ανασυνδυασμένων μεμβρανικών πρωτεϊνών, καθώς αποδείχθηκαν ιδιαίτερα αποδοτικά στην παραγωγή υψηλών ποσοτήτων μεμβρανικών πρωτεϊνών καλής ποιότητας, κατάλληλων για περαιτέρω βιοχημικές και δομικές μελέτες.