Ο ρόλος του ογκοκατασταλτικού γονιδίου Cyld στην ομοιόσταση των λιπιδίων

Abstract

The tumor suppressor CYLD is a deubiquitinase that displays specificity towards Lysine-63 and Methionine-1 polyubiquitin chains. Mutations in the Cyld gene have been associated with the development of various types of cancer. CYLD regulates an array of physiological functions, including cell cycle, programmed cell death as well as developmental processes. The implication of CYLD in the regulation of immune responses and inflammation is well established. The aim of this study was the investigation of the role of CYLD in adipose tissue homeostasis and lipogenesis. Towards this goal, in vitro models of preadipocytes, transformed hepatocytes and sebocytes were developed, incorporating genetic elements guiding the induced overexpression of the normal or catalytically inactive CYLD or the targeted ablation of CYLD, utilizing the pInducer20 and CRISPR/Cas9 systems respectively. Additionally, adipose tissue homeostasis was assessed in conditionally modified mice, in which CYLD was expressed normally or lacked exon 9 in a manner specific to the adipose tissue, by utilization of a Cre-loxP system. Under the tested conditions, efficient adipocyte differentiation of preadipocyte cell cultures was achieved. However, no statistically significant correlation between the differentiation efficiency and expression levels of CYLD was observed. The assessment of lipid content displayed lipid accumulation after induction of lipogenesis. However, the expression of CYLD did not correlate significantly with lipogenesis in the cell lines tested. The investigation of the role of CYLD in adipose tissue homeostasis showed potential implication of CYLD in the regulation of adipose tissue inflammation and/or adipocyte survival in mice fed a normal diet as well as in mice developing diet-induced obesity by administration of high-fat diet. The relevant evidence concern differential expression of genes implicated in inflammation and chemotaxis and differences in the degree of formation of crown-like structures. Given the role of chronic inflammation in the adipose tissue in the development of characteristics of metabolic syndrome, further elucidation of the effect of CYLD in the regulation of adipose tissue inflammation could reveal new pathways linking obesity to inflammation and extend the capabilities towards developing new therapeutic approaches.

Η πρωτεΐνη CYLD είναι προϊόν του γονιδίου Cyld και έχει χαρακτηριστεί ως μια ογκοκατασταλτική απoουβικουιτινάση που εξειδικεύεται στην υδρόλυση αλυσίδων πολυουβικουιτίνης διασυνδεόμενων μέσω λυσίνης 63 ή μεθειονίνης 1. Μεταλλάξεις του Cyld έχουν συσχετιστεί με διάφορους τύπους καρκίνου. Η CYLD ρυθμίζει ένα φάσμα από φυσιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένων του κυτταρικού κύκλου, του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου και διαφόρων αναπτυξιακών διεργασιών. Καλά χαρακτηρισμένος είναι ο ρόλος της CYLD στη ρύθμιση ανοσοαποκρίσεων και μηχανισμών φλεγμονής. Στόχος αυτής της διατριβής ήταν η διερεύνηση του ρόλου της CYLD στην ομοιόσταση του λιπώδους ιστού και τη λιπογένεση. Η in vitro ανάλυση αυτών των φαινομένων έγινε με την ανάπτυξη κυτταρικών σειρών προλιποκυττάρων, καρκινικών ηπατοκυττάρων και κυττάρων σμηγματογόνου αδένα που χαρακτηρίζονταν από επαγόμενη υπερέκφραση της φυσιολογικής ή καταλυτικά ανενεργής CYLD ή από απαλοιφή της έκφρασής της, με χρήση των συστημάτων pInducer20 και CRISPR/Cas9 αντίστοιχα. Οι αναλύσεις που αφορούσαν το λιπώδη ιστό πραγματοποιήθηκαν σε διαγονιδιακούς μύες που χαρακτηρίζονταν από στοχευμένη στο λιπώδη ιστό απαλοιφή του εξωνίου 9 του Cyld, που κωδικοποιεί για την καταλυτική επικράτειά της πρωτεΐνης CYLD, με χρήση του συστήματος Cre-loxP. Παρατηρήθηκε υψηλή αποδοτικότητα διαφοροποίησης προλιποκυττάρων προς λιποκύτταρα, χωρίς ωστόσο να προκύπτει στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ της αποδοτικότητας διαφοροποίησης και των επιπέδων έκφρασης της CYLD. Στα κυτταρικά μοντέλα λιπογένεσης παρατηρήθηκε αυξημένη συσσώρευση λιπιδίων κατόπιν διέγερσης της αποταμίευσής τους. Η έκφραση της CYLD δεν φάνηκε να συνδέεται σε στατιστικά σημαντικό βαθμό με τα ενδοκυτταρικά επίπεδα λιπιδίων στις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν. Η ανάλυση του ρόλου της CYLD στην ομοιόσταση του λιπώδους ιστού μυών ανέδειξε πιθανή εμπλοκή της στην ρύθμιση μηχανισμών φλεγμονής ή/και κυτταρικής επιβίωσης τόσο σε φυσιολογικές συνθήκες, όσο και σε συνθήκες που προωθούν την ανάπτυξη παχυσαρκίας με χρήση ειδικών τροφών. Οι σχετικές ενδείξεις αφορούν διαφορές στην έκφραση προφλεγμονωδών χημειοκινών και τη στρατολόγηση μακροφάγων στο λιπώδη ιστό που δημιουργούν δομές που προσομοιάζουν σε στέμμα (crown-like structures). Δεδομένου του ρόλου της χρόνιας φλεγμονής του λιπώδους ιστού στην ανάπτυξη νοσηροτήτων που σχετίζονται με το μεταβολικό σύνδρομο, η περεταίρω ανάλυση των μηχανισμών μέσω των οποίων η CYLD ρυθμίζει την ανάπτυξη φλεγμονής στο λιπώδη ιστό μπορεί να αναδείξει νέες οδούς μέσω των οποίων συσχετίζεται η παχυσαρκία με τη φλεγμονή και να επεκτείνει τις δυνατότητες ανάπτυξης νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων.