Development of a zinc-based fixative for DNA, RNA and protein molecular studies

Abstract

Fixation is a chemical process by which tissue and cell components are ‘stabilised’ temporally and spatially, preserving morphology, nucleic acids, proteins and other cell constituents. There is a wide range of fixatives, based on their chemical function, but none of the compounds used is ideal, i.e. for preserving both morphology and integrity of DNA, RNA and protein. This thesis aimed to develop a reliable, cost-effective and non-toxic fixative to meet the needs of contemporary molecular pathobiology research, particularly in respect of RNA and DNA integrity. The effects of 30 different fixative recipes on the fixed quality of tissues from C57B16 mice colon, liver and spleen were investigated. Results from immunohistochemistry (IHC), polymerase chain reaction (PCR), Reverse transcription PCR, RNA Agilent Bioanalyser and Real-Time PCR showed that a novel zinc-based fixative (Z7) containing zinc trifluoroacetate, zinc chloride and calcium acetate was significantly better than the standard zinc based fixative (Z2) and neutral buffered formalin (NBF) for DNA, RNA and protein preservation. DNA sequences up to 2.4Kb in length and RNA fragments up to 361 bp in length were successfully amplified from Z7 fixed tissues, as demonstrated by PCR, RT-PCR and Real-Time PCR. Total protein analysis was achieved using 2-D gel electrophoresis. In addition, nucleic acids and proteins were very stable in fixed tissue blocks over a 12 month period. Fresh frozen samples were also included in this experimental model as controls for DNA and RNA integrity. Using Affymetrix exon microarrays it was shown that Z7-fixed samples had no statistical significant difference in the exon alternative splicing pattern compared to fresh-frozen samples, and could be used for further human cancer array genome studies. Mass Spectroscopy studies using synthetic peptides and their reaction with zinc trifluoroacetate showed that zinc is binding to at least one amino acid, either cysteine or histidine. Future work is required to elucidate the exact chemical mechanism of zinc fixation.In conclusion, this novel, non-toxic and economical tissue fixative could be applied for routine laboratory use to permit subsequent genomic/proteomic studies.

Η μονιμοποίηση είναι μια πολύπλοκη βιοχημική διαδικασία με την οποία τμήματα ιστού και κυττάρων σταθεροποιούνται στο χώρο, συντηρώντας τη μορφολογία, τα νουκλεϊνικά οξέα, τις πρωτεΐνες και άλλα συστατικά κυττάρων. Υπάρχει ένα ευρύ φάσμα μονιμοποιητικών, ανάλογα με την βιοχημική τους λειτουργία, αλλά κανένα από αυτά δεν είναι “ιδανικό”, δηλαδή ικανό να προσφέρει διατήρηση της μορφολογίας των ιστών η των κυττάρων, της ακεραιότητας του DNA, του RNA καθώς και των πρωτεϊνών των ιστών η των κυττάρων. Αυτή η διατριβή στόχευσε να αναπτύξει ένα αξιόπιστο, οικονομικώς αποδοτικό και μη τοξικό μονιμοποιητικό για να ικανοποιήσει τις ανάγκες της σύγχρονης μοριακής παθοβιολογικής έρευνας, ιδιαίτερα για την ακεραιότητα του DNA και RNA. Τα αποτελέσματα 35 διαφορετικών μονιμοποιητικών στη ποιότητα των ιστών από 5 διαφορετικά όργανα ποντικιών C57Bl6 ερευνήθηκαν. Τα αποτελέσματα πειραμάτων με την χρήση των τεχνικών ανοσοϊστοχημείας, αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), RT-PCR, RNA Agilent Bioanalyser και Real-time PCR έδειξαν ότι ένα νέο μονιμοποιητικό με βάση τον ψευδάργυρο (Z7) που περιέχει τριφθοροοξικό ψευδάργυρο, χλωριούχο ψευδάργυρο και οξικό άλας ασβεστίου ήταν σημαντικά καλύτερο από το τυποποιημένο βασισμένο στον ψευδάργυρο μονιμοποιητικό (Z2) και την neutral buffered formalin (NBF) για το DNA, το RNA και την πρωτεϊνική διατήρηση. Ακολουθίες DNA μήκους μέχρι 2.4 Kb και RNA μήκους 361 bp ενισχύθηκαν επιτυχώς από Z7 μονιμοποιημένους ιστούς, σύμφωνα με τα αποτελέσματα των πειραμάτων με τις τεχνικές PCR, RT-PCR και Real-time PCR. Η ανάλυση ολικής πρωτεΐνης από δείγματα ιστών επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας τη 2D-PAGE ηλεκτροφόρηση. Επιπλέον, τα νουκλεϊνικά οξέα και οι πρωτεΐνες διατηρήθηκαν εξίσου καλά σε Ζ7 μονιμοποιημένους ιστούς ακόμη και μετά την πάροδο χρονικής περιόδου 18 μηνών. “Φρέσκα- παγωμένα” δείγματα περιλήφθηκαν επίσης σε αυτό το πειραματικό πρότυπο ως μάρτυρες (controls) για την ακεραιότητα DNA, RNA και πρωτεϊνών. Η χρησιμοποίηση της τεχνικής Affymetrix exon microarrays έδειξε ότι τα Ζ7 μονιμοποιημένα δείγματα από ιστούς ποντικιών, δεν είχαν καμία στατιστική σημαντική διαφορά σε όλο το γονιδίωμα όσων αφορά την έκφραση των γονιδίων όσο και το εναλλακτικό μάτισμα των εξωνίων έναντι των “φρέσκων-παγωμένων” δειγμάτων. Συνεπώς, το Ζ7 μονιμοποιητικό θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για περαιτέρω μελέτες χρησιμοποιώντας ανθρώπινους ιστούς φυσιολογικούς και καρκινικούς. Μελέτες φασματομετρίας μάζας (ΜALDI-TOF MS/MS), όπου χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά πεπτίδια και μελετήθηκε η αλληλεπίδραση τους με το άλας τριφθοροoξικού ψευδαργύρου έδειξαν ότι ο ψευδάργυρος δεσμεύεται τουλάχιστον από ένα αμινοξύ, και συγκεκριμένα μια κυστεΐνη ή μια ιστιδίνη, με πιθανή επίσης την ύπαρξη ενός συμπλόκου κυστεΐνης-ψευδαραργύρου-ιστιδίνης. Περαιτέρω ερευνητική εργασία απαιτείται για να διευκρινιστεί ο ακριβής χημικός μηχανισμός της μονιμοποίησης με ψευδάργυρο. Τελικά, αυτό το νέο, μη τοξικό και οικονομικό μονιμοποιητικό ιστών και κυττάρων θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σε τακτική βάση τόσο σε ερευνητικά όσο και σε διαγνωστικά εργαστήρια και επιπλέον να επιτρέψει γενομικές και πρωτεομικές μελέτες.