Μελέτη της στοχαστικής ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης σε ευκαριωτικούς οργανισμούς

Abstract

Cellular reprogramming is the process of converting almost any cell type into cells that are almost identical to Embryonic Stem Cells (ESCs) and are called induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs). The above is mainly achieved through the overexpression of four transcription factors, Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc (OSKM) in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) which after 18 days will transform into iPSCs. Previous findings by the research team demonstrated the involvement of a network of nine transcriptional regulators (of Taf1c, Tead4, Tfap4, Rcan1, Cbfa2t3, Gli2, Irf6, Ovol1 and Nanog) which when co-expressed in the same cells on day 6 of the process, the probability of transformation into iPSCs is increased significantly, while the involvement of a specific histone variant, macroH2A, in the reprogramming process was also highlighted. In this PhD thesis, the molecular mechanisms by which macroH2A is involved in cellular reprogramming during the abandonment of the somatic phenotype but also during the adoption of pluripotency were investigated and the role of nine transcription factors during cellular reprogramming was further explored. Regarding the role of macroH2A, focus was placed on mechanisms by which macroH2A variants inhibit reprogramming functioning as gatekeepers of mesenchymal cell status via the prevention of mesenchymal to epithelial transition (MET), a step required for fibroblast reprogramming. More specifically, individual macroH2A variants regulate the expression of a defined sets of genes, whose overall function is to stabilize the expression program of the mesenchymal phenotype, thereby providing resistance to reprogramming. We identified a novel gene network (mesenchymal network, MSCN), consisting of 63 genes regulated by macroH2A, related to extracellular substance, cell membrane, signaling, and the transcriptional regulators Id2 and Snai2, thusfunctioning as guardians of the mesenchymal phenotype. ChIP-seq and silencing experiments revealed a combinatorial variant-specific targeting of genes that reconstitute MSCN, providing stability to gene expression programs to resist cellular reprogramming. In addition, macroH2A1 but not macroH2A2 variants were shown to undergo dynamic redistribution in the genome during reprogramming, which occurs largely near the transcription start site of a distinct set of genes. As for the macroH2A1.2 isoform, disappearance occurs on day 1 of reprogramming and reappearance in the same genes on day 3 but with a shift of the new site by an average of 50 bp. The translocation is associated with a change in the expression status of regulated genes that are related to cell cycle regulation. In particular, the displacement results in covering the binding sites of the transcription factor E2F4 which is a negative regulator of cell division, thus inhibiting the impending negative effect on the cell cycle, contributing to the release of cell proliferation. The activity of macroH2A1.1 is associated with the occupation of a multitude of new genomic positions in the state of pluripotency, which involve binding sites and target genes of the core pluripotency network comprised of Oct-4, Sox2 and Nanog. Regarding the role of the nine transcriptional regulators, enhancer traps were constructed and used for all transcription factors. The DNA regulatory regions of Ovol1 and Irf6 were characterized as Reprogramming Specific Enhancers (RSEs), i.e. regulatory elements that are activated only during cellular reprogramming. In this way, we succeeded in isolating pure populations of cells expressing the above genes. Both subpopulations show a higher yield of iPSC colonies than the rest of the cell population, while RNA sequencing (RNAseq) analysis revealed the specificity of these cells to carry out the Mesenchymal to Epithelial Transition (MET), while network analysis of the above-mentioned cell subpopulations revealed the involvement of metallopeptidase 9 (MMP9). This enzyme specializes in the modification of the extracellular substance and is associated in the literature as EMT/MET regulator. Pharmacological inhibition of MMP9 resulted in the selective lysis of early colonies in contrast to cells that already possess the epithelial phenotype such as hepatocytes, which are unaffected by the inhibitor's effect, while Knockdown experiments combined with FACS analysis revealed the incompetence of cells without MMP9 to acquire epithelial characteristics. MMP9 expression climaxes at Day 6 of reprogramming, only in the context of preliminary iPSCs formations, implicating its specialized yet stochastic regulation. ChIP-seq analysis against Irf6 and Ovol1 showed the induced direct binding of transcription factors at the regulatory region of the Mmp9 gene, while a genome-wide study of binding events revealed that the binding of Ovol1 coincides with the binding events of Tead4, a transcriptional regulator of the 9GRN network of transcriptional regulators that is expressed from the start of the process. In vitro assays verified the binding of these factors to specific targets which can be cooperative in some cases. In conclusion, the MMP9 molecule was identified as a critical regulator of the course of reprogramming after the completion of MET, while the critical role of endogenous factors (i.e. outside OSKM) which act cooperatively to abandon the mesenchymal character in order to adopt the epithelial character and eventually leading to the establishment of pluripotency.

Ο κυτταρικός επαναπρογραμματισμός είναι η διαδικασία μετατροπής σχεδόν οποιουδήποτε κυτταρικού τύπου σε κύτταρα τα οποία είναι σχεδόν ίδια με τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (Embryonic Stem Cells, ESCs) και ονομάζονται επαγόμενα βλαστικά κύτταρα (induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs). Το παραπάνω επιτυγχάνεται μέσω της υπερέκφρασης τεσσάρων μεταγραφικών παραγόντων, των Οct4, Sox2, Κlf4 και c-Myc (OSKM) σε εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού (Mouse Embryonic Fibroblasts, MEFs) οι οποίοι μετά από 18 ημέρες θα μετατραπούν σε iPSCs. Προηγούμενα ευρήματα της ερευνητικής ομάδας επέδειξαν την εμπλοκή ενός δικτύου εννέα μεταγραφικών ρυθμιστών (των Taf1c, Tead4, Tfap4, Rcan1, Cbfa2t3, Gli2, Irf6, Ovol1 και Nanog) οι οποίοι όταν συνεκφρασθούν στα ίδια κύτταρα την 6η ημέρα της διαδικασίας, αυξάνεται σημαντικά η πιθανότητα το κύτταρα αυτά να μετατραπούν σε iPSCs, ενώ αναδείχθηκε και η συμμετοχή μία συγκεκριμένης ιστονικής παραλλαγής, της macroH2A στη διαδικασία του επαναπρογραμματισμού. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, διερευνήθηκαν οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους η macroH2A εμπλέκεται στον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό κατά την εγκατάλειψη του σωματικού φαινοτύπου αλλά και κατά την υιοθέτηση της πολυδυναμίας και προσδιορίστηκε ο ρόλος των εννέα μεταγραφικών παραγόντων κατά τον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό. Όσον αφορά στο ρόλο της macroH2A, ερευνήθηκαν μηχανισμοί με τους οποίους οι ισομορφές macroH2A αναστέλλουν τον επαναπρογραμματισμό και ανακαλύψαμε ότι λειτουργούν ως φύλακες της κατάστασης των μεσεγχυματικών κυττάρων εμποδίζοντας την μετάβαση στο επιθήλιο (MET), ένα βήμα που απαιτείται για τον επαναπρογραμματισμό των ινοβλαστών. Πιο συγκεκριμένα, διαπιστώσαμε ότι μεμονωμένες ισομορφές macroH2A ρυθμίζουν την έκφραση καθορισμένων συνόλων γονιδίων, των οποίων η συνολική λειτουργία είναι να σταθεροποιούν το πρόγραμμα έκφρασης του μεσεγχυματικού φαινοτύπου, παρέχοντας με αυτόν τον τρόπο αντίσταση για την πραγματοποίηση του επαναπρογραμματισμού. Εντοπίσαμε ένα νέο δίκτυο γονιδίων (μεσεγχυματικό δίκτυο, mesenchymal network, MSCN), το οποίο αποτελείται από 63 γονίδια ρυθμιζόμενα από τη macroH2A, τα οποία σχετίζονται με την εξωκυττάριο ουσία, την κυτταρική μεμβράνη, τη σηματοδότηση και με τους μεταγραφικούς ρυθμιστές Id2 και Snai2, λειτουργώντας ως φύλακας του μεσεγχυματικού φαινοτύπου. Τα πειράματα ChIP-seq και σίγησης αποκάλυψαν μια συνδυαστική στόχευση ειδική για κάθε ισομορφή macroH2A των γονιδίων που ανασυνθέτουν το MSCN, παρέχοντας σταθερότητα στα προγράμματα γονιδιακής έκφρασης, προκειμένου να αντισταθούν στον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό. Επιπλέον, δείχθηκε πως οι ισομορφές της macroH2A1 αλλά όχι της macroH2A2 παρουσιάζουν δυναμική ανακατανομή στο γονιδίωμα κατά τη διάρκεια του επαναπρογραμματισμού, η οποία λαμβάνει χώρα σε μεγάλο βαθμό κοντά στο σημείο έναρξης της μεταγραφής πληθώρας γονιδίων. Όσον αφορά στην ισομορφή macroH2A1.2, εμφανίζεται εξαφάνιση κατά την ημέρα 1 του επαναπρογραμματισμού και εναμεμφάνιση στα ίδια γονίδια την ημέρα 3 αλλά με μία μετατόπιση της νέας θέσης κατά μέσο όρο 50 βάσεων. Η μετατόπιση σχετίζεται με αλλαγή της κατάστασης έκφρασης των ρυθμιζόμενων γονιδίων τα οποία σχετίζονται με τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Ειδικότερα, η μετατόπιση έχει ως αποτέλεσμα την κάλυψη θέσεων πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα E2F4 ο οποίος αποτελεί αρνητικό ρυθμιστή της κυτταρικής διαίρεσης, αναστέλλοντας έτσι την επικείμενη αρνητική δράση στον κυτταρικό κύκλο, συμβάλλοντας στην απελευθέρωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Ηδραστηριότητα της macroH2A1.1 σχετίζεται με την κατάλληψη πληθώρας νέων γονιδιωματικών θέσεων στην κατάσταση της πολυδυναμίας, οι οποίες θέσεις αφορούν σε περιοχές πρόσδεσης αλλά και στόχους του βασικού δικτύου πολυδυναμίας, το οποίο απαρτίζεται από τους Oct-4, Sox2 και Nanog. Όσον αφορά στο ρόλο των εννέα μεταγραφικών ρυθμιστών, κατασκευάσθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν παγίδες ρυθμιστικών στοιχείων (enhancer traps) για όλους τους μεταγραφικούς παράγοντες. Οι περιπτώσεις των ρυθμιστικών περιοχών των Ovol1 και Irf6 αποτελούν ειδικούς για τον επαναπρογραμματισμό ενισχυτές (Reprogramming Specific Enhancers, RSEs), δηλάδη ρυθμιστικών στοιχείων τα οποία ενεργοποιούνται μόνο κατά τον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό. Με αυτόν τον τρόπο, καταφέραμε να απομονώσουμε αμιγείς πληθυσμούς κυττάρων που εκφράζουν τα παραπάνω γονίδια. Και οι δύο υποπληθυσμοί εμφανίζουν μεγαλύτερη απόδοση στη δημιουργία αποικιών iPSC σε σχέση με τον υπόλοιπο κυτταρικό πληθυσμό, ενώ ανάλυση αλληλούχησης RNA (RNAseq) αποκάλυψε την ιδιαιτερότητα αυτών των κυττάρων να πραγματοποιούν τη μετάβαση από το Μεσέγχυμα στο Επθήλιο (MET), ενώ ανάλυση δικτύων σε αυτούς τους κυτταρικούς υποπληθυσμούς αποκάλυψε την εμπλοκή της μεταλοπεπτιδάσης 9 (MMP9). Αυτό το ένζυμο εξειδικεύεται στην τροποποίηση της εξωκυττάριας ουσίας και σχετίζεται βιβλιογραφικά με την ανάστροφη διαδικασία της ΜΕΤ. Φαρμακολογική αναστολή της ΜΜΡ9 είχε ως αποτέλεσμα την επιλεκτική αποσάθρωση των πρώιμων αποικιών σε αντίθεση κύτταρα τα οποία διαθέτουν ήδη το επιθηλιακό φαινότυπο όπως ηπατοκύτταρα, τα οποία δεν επηρεάζονται από τη δράση του αναστολέα. Ανάλυση ChIP-seq έναντι των Irf6 και Ovol1 έδειξε την επαγόμενη πρόσδεση των μεταγραφικών παραγόντων στη ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου Mmp9, ενώ μελέτη των γεγονότων πρόσδεσης σε όλο το γονιδίωμα αποκάλυψε πως η πρόσδεση του Ovol1 συμπίπτει με τα γεγονότα πρόσδεσης του Tead4, ενός μεταγραφικού ρυθμιστή μέλος του αρχικού δικτύου μεταγραφικών ρυθμιστών ο οποίος εκφράζεται από την έναρξη της διαδικασίας. Με δοκιμασίες in vitro επαληθεύσαμε την πρόσδεση των παραγόντων αυτών σε συγκεκριμένους στόχους η οποία μπορεί να είναι κατά περίπτωση συνεργατική. Συμπερασματικά, ταυτοποιήθηκε το μόριο ΜΜΡ9 ως κρίσιμος ρυθμιστής της πορείας του επαναπρογραμματισμού μετά την ολοκλήρωση της ΜΕΤ ενώ αποκαλύφθηκε και ο κρίσιμος ρόλος ενδογενών παραγόντων (δηλαδή εκτός OSKM) οι οποίοι δρουν συνεργατικά για την εγκατάλειψη του μεσεγχυματικού χαρακτήρα και την υιοθέτηση καταρχάς του επιθηλιακού χαρακτήρα και εν τέλει την εγκαθίδρυση της πολυδυναμίας.