Μελέτη των γονιδίων και ρυθμιστικών στοιχείων που εμπλέκονται στην αντιγραφή και μεταγραφή του μιτοχονδριακού γονιδιώματος στους εντομοπαθογόνους μύκητες Beauveria bassiana και Metarhizium brunneum

Abstract

Entomopathogenic fungi and in particular the genera Beauveria and Metarhizium have been exploited for the biological control of pests. Genome analyses are important to understand better their mode of action and thus, improve their efficacy against their hosts. Until now, the sequences of their mitochondrial genomes were studied, but not at the level of transcription. In all other Ascomycota, with the exception of yeasts and Neurospora crassa whose mt gene transcription is well described, related information is extremely scarce. In this work, mt transcription and key enzymes of this function were studied. RTPCR experiments and Northern hybridizations reveal the transcriptional map of the mt genomes of B. bassiana and M. brunneum species. The mt genes are transcribed in six main transcripts and undergo post-transcriptional modifications to create single gene transcripts. Promoters were determined in both mt genomes with a comparative in silico analysis, including all known information from other fungal mt genomes. The promoter consensus sequence is 5'-ATAGTTATTAT-3' which is in accordance with the definition of the polycistronic transcripts determined with the experiments described above. Moreover, 5'-RACE experiments in the case of premature polycistronic transcript nad1-nad4-atp8-atp6 revealed the 5' end of the RNA transcript immediately after the in silico determined promoter, as also found in other fungal species. The endpoints of these abundant mitochondrial transcripts generally coincide with those of tRNA sequences. We therefore conclude that tRNA sequences in some polycistronic transcripts act as primary signals for RNA processing in mitochondria of these entomopathogenic fungi (Punctuation model: single tRNAs may play this role). In this study, the strongest evidence for tRNA sequences being primary signals in mitochondrial RNA processing comes from an analysis of transcription units 4 and 5 (cox1-trnR2 and nad1-nad4-atp8-atp6, respectively). The 3'-termini of mRNAs and LSU rRNA are proposed to be distinct 5'-TAAATT-3' motifs that are located at a variable distance (1–218 nt) downstream from mRNA and LSU-rRNA coding regions. Since several conserved elements were retrieved from these analyses compared to the already known data from yeasts and N. crassa, the phylogenetic analyses of mt RNA polymerase (Rpo41) and its transcriptional factor (Mtf1) were performed in order to define their evolution. As expected, it was found that fungal Rpo41 originate from the respective polymerase of T7/T3 phages, while the ancestor of Mtf1 is of alphaproteobacterial origin. Therefore, this study presents insights about the fidelity of the mt single-subunit phage-like RNA polymerase during transcription, since the correct identification of mt promoters from Rpo41 requires an ortholog to bacterial sigma factor, i.e., Mtf1. Thus, a previously proposed hypothesis of a phage infected alphaproteobacterium as the endosymbiotic progenitor of mitochondrion is confirmed in this study and further upgraded by the co-evolution of the bacterial (Mtf1) and viral originated (Rpo41) components in one functional unit. Meanwhile, the mitochondrial DNA polymerase γ (Mip1) of Metarhizium brunneum (strain ARSEF 3297) was characterized. Τhe proteins necessary for replication (e.g. DNA Polymerase Gamma) and for transcription (e.g. Mitochondrial RNA Polymerase) of the mtDNA, and generally those which are involved in the maintenance of mtDNA, are encoded by nuclear genes. It is also known that several of the proteins involved in mitochondrial replication and transcription have homology with the respective genes of bacteriophages. In this study, a combined in silico structure of Mip1-Rpo41-Mtf1 holoenzyme for initiation of mtDNA replication is proposed in fungi, particularly M. brunneum, based on the hypothesis that Rpo41 synthesizes primers that are used for primer extension by Mip1 at origin of replications, which have been recognized (in silico) in this thesis. Disruption mutants show Mip1 to be essential for cell growth, morphology, germination and stress tolerance. Underexpression of Mip1 (Δmip1) does not cause a reduction in transcription of mitochondrial genes, suggesting that Mip1 is not required for efficient transcription. The functional differences between Mip1 of M. brunneum with Saccharomyces cerevisiae and higher organisms are discussed in this thesis. In contrast to S. cerevisiae, the established model for mitochondrial DNA replication for M. brunneum resembles higher organisms that cannot tolerate the loss of mitochondrial function. The M. brunneum and human mitochondrial genomes are similar in size and much smaller than the respective genome of S. cerevisiae. Overall, this thesis is an important first step in the recognition of M. brunneum as an alternative and complementary model system for molecular genetic and biochemical studies of mitochondrial DNA replication and mitochondrial–nuclear interactions. This is the first systematic study of the cellular function of Mip1 in entomopathogenic fungi.

Οι εντομοπαθογόνοι μύκητες και πιο συγκεκριμένα τα γένη Beauveria και Metarhizium έχουν αξιοποιηθεί παγκοσμίως για τη βιολογική καταπολέμηση των εντόμων παρασίτων στις αγροτικές καλλιέργειες ως παράγοντες βιολογικού ελέγχου (BCAs). Οι γονιδιωματικές αναλύσεις είναι σημαντικές για την καλύτερη κατανόηση του τρόπου δράσης των παραπάνω μυκήτων, και επομένως για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητάς τους έναντι των εντόμων - ξενιστών. Μέχρι στιγμής έχουν μελετηθεί οι αλληλουχίες των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων τους, αλλά όχι σε επίπεδο μεταγραφής. Εκτός από τους ζυμομύκητες και τον υφομύκητα Neurospora crassa, των οποίων η μεταγραφή των μιτοχονδριακών γονιδίων έχει περιγραφεί σε ικανοποιητικό βαθμό, στους υπόλοιπους Ασκομυκητες, και συγκεκριμένα στο Υπόφυλο Pezizomycotina, οι σχετικές πληροφορίες είναι λιγοστές. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η μεταγραφή του μιτοχονδριακού γονιδιώματος στους υπό εξέταση εντομοπαθογόνους μύκητες, καθώς και τα βασικά ένζυμα που εμπλέκονται σε αυτήν τη βασική μιτοχονδριακή λειτουργία. Μέσω πειραμάτων RT-PCR και υβριδισμών κατά Northern αποκαλύφθηκε ο δομικός μεταγραφικός χάρτης των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων στα είδη B. bassiana και M. brunneum. Τα mt-γονίδια και στους δύο υπό μελέτη μύκητες μεταγράφονται σε έξι κύριες πολυσιστρονικές μεταγραφικές μονάδες και έπειτα κάθε μία υφίσταται μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις για τη δημιουργία των μονοσιστρονικών μεταγράφων. Οι μιτοχονδριακοί υποκινητές προσδιορίστηκαν και στα δύο mt-γονιδιώματα μέσω συγκριτικής in silico ανάλυσης, η οποία διενεργήθηκε σε μεγάλο πλήθος μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων από την τάξη Hypocreales, λαμβάνοντας υπόψη και όλες τις ήδη γνωστές πληροφορίες που υπήρχαν βιβλιογραφικά και από άλλα μιτοχονδριακά γονιδιώματα μυκήτων. Η συναινετική αλληλουχία των mt υποκινητών είναι 5'-ATAGTTATTAT-3', και είναι σύμφωνη με τον ορισμό των πολυσιστρονικών μεταγραφικών μοναδων, που προσδιορίστηκαν μέσω της πειραματικής διαδικασίας που περιγράφηκε παραπάνω. Επιπλέον, πείραμα 5'-RACE PCR, στην περίπτωση της 5ης πολυσιστρονικής μεταγραφικής μονάδας (nad1-nad4-atp8-atp6), αποκάλυψε το 5'-άκρο του RNA μεταγράφου, αμέσως μετά τον in silico καθορισμένο mt-υποκινητή, όπως έχει ήδη περιγραφεί και στη N. crassa και τις ζύμες, ανοδικά του πρώτου γονιδίου του εκάστοτε πολυσιστρονικού μεταγράφου. Παράλληλα με την ανάλυση των 5'-άκρων των πρωτογενών πολυσιστρονικών μεταγράφων στους εντομοπαθογόνους μύκητες, οδηγηθήκαμε στο συμπέρασμα ότι τα tRNA γονίδια ενδέχεται να λειτουργούν ως σημεία λήξης της mt-μεταγραφής σύμφωνα με το «λειτουργικό μοντέλο» (functional model). Ισχυρή ένδειξη αποτελεί η in vitro ανάλυση των πολυσιστρονικών μονάδων 4 και 5 (cox1-trnR2 και nad1-nad4-atp8-atp6, αντίστοιχα), τόσο στο μύκητα B. bassiana όσο και στο M. brunneum, με το συντηρημένο μοτίβο της αλληλουχίας λήξης να διαμορφώνεται ως εξής: 5'-TAAATT-3', καθοδικά του τελευταίου γονιδίου του εκάστοτε πολυσιστρονικού μεταγράφου. Δεδομένου ότι από τις παραπάνω μελέτες ανακτήθηκαν αρκετά συντηρημένα στοιχεία σε σύγκριση με τα ήδη γνωστά δεδομένα, πραγματοποιήθηκαν εξελικτικές - φυλογενετικές αναλύσεις για την mt-RNA πολυμεράση (Rpo41) και τον μεταγραφικό παράγοντά της (Mtf1), προκειμένου να καθοριστεί η πορεία εξέλιξης τους. Έπειτα από βιοπληροφορική έρευνα βρέθηκε ότι η Rpo41 των μυκήτων προέρχεται από την αντίστοιχη πολυμεράση των βακτηριοφάγων Τ7/Τ3, και για λόγους που χρήζουν περαιτέρω εξέτασης, η συγκεκριμένη φαγική προγονική RNA πολυμεράση παρέμεινε στο αρχέγονο μιτοχόνδριο ως πλήρως λειτουργική, ενώ ο πρόγονος του Mtf1 εξελίχθηκε από το μεταγραφικό παράγοντα σίγμα ενός α πρωτεοβακτηρίου. Επομένως, αυτή η μελέτη παρουσιάζει πληροφορίες σχετικά με την πιστότητα της μοναδικής υπομονάδας της mt-RNA πολυμεράσης κατά τη μεταγραφή, καθώς η σωστή αναγνώριση των μιτοχονδριακών υποκινητών από την Rpo41 απαιτεί ένα παράγοντα παρόμοιο με τον βακτηριακό παράγοντα σίγμα (σ), δηλαδή τον Mtf1. Έτσι, η υπόθεση ενός μολυσμένου με φάγου α-πρωτεοβακτηρίου, ως ενδοσυμβιωτικού προγόνου του μιτοχονδρίου επιβεβαιώνεται σε αυτήν τη διδακτορική διατριβή και αναβαθμίζεται περαιτέρω από την ύπαρξη συνεξέλιξης μεταξύ των λειτουργικών συστατικών του ολοενζύμου της μιτοχονδριακής μεταγραφής, τα οποία προέρχονται τόσο από βακτήρια (Mtf1) όσο και από ιούς (Rpo41). Στο δεύτερο σκέλος της διδακτορικής διατριβής, πραγματοποιήθηκε χαρακτηρισμός της μιτοχονδριακής DNA πολυμεράσης γ (Mip1) του M. brunneum. Οι πρωτεΐνες που είναι απαραίτητες για την αντιγραφή (π.χ. DNA πολυμεράση γ) και για τη μεταγραφή (π.χ. μιτοχονδριακή RNA πολυμεράση) του mtDNA, και γενικά αυτές που εμπλέκονται στη διατήρηση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος, είναι γνωστό ότι κωδικοποιούνται από πυρηνικά γονίδια. Όπως προαναφέρθηκε και παραπάνω, αρκετές από τις πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην αντιγραφή και έκφραση του mtDNA έχουν ομολογία με τα αντίστοιχα γονίδια των βακτηριοφάγων. Στην παρούσα διατριβή, μία in silicο συνδυαστική δομή του ολοενζύμου Mip1 – Rpo41 – Mtf1 για την έναρξη της αντιγραφής του mtDNA προτάθηκε με βάση την υπόθεση ότι η Rpo41 συνθέτει εκκινητές που χρησιμοποιούνται για την έναρξη του πολυμερισμού από την Mip1 στην περιοχή έναρξης της αντιγραφής (ori/rep). Πιο αναλυτικά, παράλληλα με την in silico ανάλυση των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων, εντοπίστηκε, με βάση ειδικά κριτήρια που επιλέχθηκαν, μία περιοχή έναρξης της αντιγραφής (ori/rep), τόσο στο είδος B. bassiana όσο και στο M. brunneum, στην περιοχή ενδιάμεσα του trnP γονιδίου και της rnl – μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας. Παράλληλα με τη μελέτη της δομικής μεταγραφικής οργάνωσης των mt γονιδιωμάτων και των εντοπισμό υποκινητών και αλληλουχιών τερματισμού της μεταγραφής, σημαντικό στοιχείο της μελέτης του μύκητα M. brunneum αποτελούσε και η αναγνώριση – εξέταση in vivo του κύριου εμπλεκόμενου πυρηνικού γονιδίου στην μιτοχονδριακή αντιγραφή (mip1 – μιτοχονδριακή DNA πολυμεράση γ), το οποίο ενδέχεται να συνεισφέρει και στην εντομοπαθογονική συμπεριφορά του μύκητα, πέρα της βασικής τους λειτουργίας στον κυτταρικό κύκλο και κατ’ επέκταση στην φυσιολογία του. Όσον αφορά τις μεταλλαγές διαγραφής – αποσιώπησης στο γονίδιο mip1, διαπιστώθηκε ότι η πρωτεΐνη Mip1 είναι απαραίτητη για την κυτταρική ανάπτυξη, τη μορφολογία, την εκβλάστηση των κονιδίων καθώς και την αντοχή σε συνθήκες στρες στο στέλεχος M. brunneum ARSEF 3297. Η υποέκφραση της πρωτεΐνης Mip1 δεν προκαλεί μείωση της μεταγραφής των μιτοχονδριακών γονιδίων σε σχέση με τα επίπεδα στο στέλεχος φυσικού τύπου, υποδηλώνοντας ότι η Mip1 δεν απαιτείται για την επιτυχή διεκπεραίωση της μιτοχονδριακής μεταγραφής. Συγκεκριμένα, εντοπίστηκαν λειτουργικές διαφορές μεταξύ του Μ. brunneum (Δmip1) με τα αντίστοιχα στελέχη στο μύκητα Saccharomyces cerevisiae και στους ανώτερους οργανισμούς. Σε αντίθεση με το S. cerevisiae, ο μηχανισμός της αντιγραφής του μιτοχονδριακού DNA στο M. brunneum, ομοιάζει με αυτόν που παρατηρείται στους ανώτερους οργανισμούς, οι οποίοι δεν μπορούν να επιβιώσουν από την απώλεια της μιτοχονδριακής λειτουργίας, καθώς υπήρξε αδυναμία απομόνωσης knock-out στελέχους. Ακόμα, τα μιτοχονδρικά γονιδιώματα στο στέλεχος ARSEF 3297 και στον άνθρωπο είναι παρόμοια σε μέγεθος και πολύ μικρότερα από αυτό του S. cerevisiae. Συμπερασματικά, η παραπάνω έρευνα (Δmip1) αποτελεί την πρώτη συστηματική μελέτη της κυτταρικής λειτουργίας της πρωτεΐνης DNA πολυμεράσης γ στον εντομοπαθογόνο μύκητα M. brunneum.