Lipid-membrane systems for the study of protein interactions using acoustic biosensors

Abstract

Membrane-mimicking platforms have provided valuable information into a range of molecular recognition events associated with biological phenomena. These model systems simplify complex biological processes by limiting and fixing factors that are otherwise dynamic in cells and in vivo systems. Membrane-mimicking systems have been successfully developed and used with acoustic sensors. Specifically, Supported Lipid Bilayers (SLBs) and Small Unilamellar Vesicles (SUVs) have been extensively employed with the Quarz CrystalMicrobalance with Dissipation monitoring (QCM-D) technique. In this PhD research project, we mainly focus on mimicking the early endosomal (EE)membranes harboring the vesicle tethering/fusion machinery. The 200 nm long coiled-coilprotein EEA1 tethers vesicles bearing the small GTPase Rab5 which alternates between inactive (Rab5.GDP) and active (Rab5.GTP) conformations. Binding of Rab5.GTP to EEA1 induces a transition from extended to flexible, thereby mechanically pulling membranes closerfor fusion. In addition, EEA1 is present at high density on EE membranes and, as such, formsa novel, potentially switchable, polymer brush. However, the details of such a mechanism remain unknown. In order to elucidate the organization and mechanical properties of suchbiological membranes we designed an in vitro assay using SLBs and a minimal set of proteins present on EE membranes. EEA1 was first anchored to its lipid partner, phosphatidylinositol3-phosphate (PI(3)P). Furthermore, we studied the effect of different lipids that are present onEE membranes and tested the specificity of the experimental set-up. One of the main findings is that, although PI(3)P is the key lipid for the EEA1-membrane interaction, cholesterol(Chol) and phospatidylserine (PS) lipids, greatly influenced the amount and kinetics of EEA1 binding to membranes. Next, we were able to reproduce EEA1 and Rab5.GTP interaction on QCM-D surfaces. Towards this end, available models to analyze the QCM-D data were employed with emphasis on the viscoelastic model. Having established the above-mentioned, we set the basis of an in vitro, real-time assay to further monitor structural changes and mechanical properties of EEA1 upon Rab5.GTP binding.x In addition to EEA1, we studied two more proteins using membrane-mimetic systems. The first one was recently found to interact with Rab5.GDP and was identified as Acetoacetyl-CoA Thiolase 2 (ACAT2). In this study, we tested in vitro the interaction of Rab5.GDP withACAT2 in order to gain information on this protein-protein interaction, the specificity and the stoichiometry of their binding event. Rab5.GDP was attached on SLB-covered surfaces and subsequently, ACAT2 was added in different concentrations. We found that ACAT2 interactswith Rab5.GDP upon incubation. Results also indicate that ACAT2 could possibly interactwith lipid membranes too. The last protein employed in this work is Sec Fourteen-Homologue 8 (SFH8), a lipidbinding protein, also studied herein with the QCM-D technique. We used Small UnilamellarVesicles (SUVs) on QCM-D surfaces in order to study SFH8 binding. SFH8 is found in Arabidopsis thaliana and is involved in lipid transferring and also found to interact with kinesin from the KInesin-Separase Complex (KISC). First, we tested the binding of SFH8 to different negatively charged lipids and found that the binding is not specific to either of them.The results suggest that SFH8 is associated with membranes via non-specific electrostaticinteractions rather than via a recognition of a motif. Furthermore, SFH8 has an intrinsically disordered region (IDR) and our results indicate that this domain is likely responsible forSFH8 membrane interaction in vitro. Last, we verified SFH8/kinesin interaction. Overall, the QCM-D technique has proven to be a versatile tool for designing and studying bio-interfaces in order to gain insights into biological membranes and their interactions with proteins. Furthermore, the membrane mimicking films can be easily modified to studyprotein-protein interactions.

Οι πλατφόρμες που μιμούνται μεμβράνες δίνουν σημαντικές πληροφορίες για μια σειρά από γεγονότα μοριακής αναγνώρισης που σχετίζονται με βιολογικά φαινόμενα. Αυτά τα μοντέλα μεμβρανών απλοποιούν τις πολύπλοκες βιολογικές διεργασίες περιορίζοντας και σταθεροποιώντας παράγοντες που είναι κατα τ ́άλλα δυναμικοί στα κύτταρα και σε in vivo συστήματα. Τα μοντέλα-μεμβράνες έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε ακουστικούς αισθητήρες. Ειδικότερα, οι υποστηριζόμενες λιπιδικές διπλοστοιβάδες (SLBs) και τα μικρά μονοστρωματικά κυστίδια (SUVs) έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς με την τεχνική του ακουστικού βιοαισθητήρα QCM-D. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, επικεντρωνόμαστε κυρίως στη μίμηση των μεμβρανών των πρώιμων ενδοσωμάτων (ΠΕ) όπου η πρωτεΐνη ΕΕΑ1, μήκους 200 nm, προσδένετε σε λιπιδικά κυστίδια που φέρουν τη μικρή GTPάση Rab5 η οποία αλλάζει μεταξύ ανενεργής (Rab5.GDP) και ενεργής (Rab5.GTP) μορφής. Η σύνδεση της Rab5.GTP στηνΕΕΑ1 προκαλεί μια αλλοστερική αλλαγή στη δομή της ΕΕΑ1 η οποία γίνεται πιο ευλύγιστη. Η αλλαγή αυτή έχει ως αποτέλεσμα να προσεγγίζονται μηχανικά οι μεμβράνες για σύντηξη. Ωστόσο, οι λεπτομέρειες και ο τρόπος λειτουργίας ενός τέτοιου συστήματος παραμένουν άγνωστες. Για να μελετήσουμε την οργάνωση και τις μηχανικές ιδιότητες τέτοιων βιολογικών μεμβρανών, σχεδιάσαμε ένα in vitro σύστημα χρησιμοποιώντας SLBs και ένα ελάχιστο αριθμό πρωτεϊνών που βρίσκονται στις μεμβράνες των ΕΕ. Αρχικά η ΕΕΑ1 προσδένεται στο λιπίδιο ινοσιτόλης (PI(3)P). Επιπλέον, μελετήσαμε την επίδραση διαφορετικών λιπιδίων που βρίσκονται στις μεμβράνες του ΠΕ και δοκιμάσαμε την ειδικότητα της πειραματικής διάταξης. Βρήκαμε ότι, αν και το PI(3)P είναι το βασικό λιπίδιο για την αλληλεπίδραση της ΕΕΑ1 με τις μεμβράνες των ενδοσομάτων, τα λιπίδια χοληστερόλης (Chol) και φωσφατιδυλοσερίνη (PS) επηρεάζουν σημαντικά την ποσότητα και την κινητική της ΕΕΑ1 στις λιπιδικές μεμβράνες. Στη συνέχεια, καταγράψαμε την αλληλεπίδραση της ΕΕΑ1 με την Rab5.GTP στις επιφάνειες του βιοαισθητήρα QCM-D. ́Εχοντας επαληθεύσει τα παραπάνω, θέτουμε τις βάσεις για μια in vitro διάταξη σε πραγματικού χρόνου για την περαιτέρω παρακολούθηση δομικών αλλαγών και μηχανικών ιδιοτήτων της πρωτεΐνης ΕΕΑ1 μετά από την αλληλεπίδραση με την Rab5.GTP.vii Εκτός από την ΕΕΑ1, μελετήσαμε και άλλες δύο πρωτεΐνες χρησιμοποιώντας συστήματα που μιμούνται μεμβράνες. Η πρώτη από αυτές πρόσφατα ανακαλύφθηκε ότι αλληλεπιδράμε την Rab5.GDP και αναγνωρίστηκε ως Acetoacetyl-CoA Thiolase 2 (ACAT2). Σε αυτήν τη μελέτη, δοκιμάσαμε in vitro την αλληλεπίδραση της Rab5.GDP με την ACAT2για να αποκτήσουμε πληροφορίες για αυτήν την πρωτεΐνη-πρωτεΐνη αλληλεπίδραση, την ειδικότητα και τον στοιχειώδη τύπο της αλληλεπίδρασής τους. Η Rab5.GDP προσδέθηκεσε μεμβράνες (SLB) και στη συνέχεια προσθέσαμε την ACAT2. Βρήκαμε ότι η ACAT2 αλληλεπιδρά με την Rab5.GDP μετά από επώαση. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν επίσης ότι η ACAT2 μπορεί να αλληλεπιδρά με τις μεμβράνες λιπιδίων. Η τελευταία πρωτεΐνη που χρησιμοποιήθηκε σε αυτήν την εργασία είναι η Sec Fourteen-Homologue 8 (SFH8), μια πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με λιπίδια και μελετήθηκε επίσης με την τεχνική QCM-D. Χρησιμοποιήσαμε μικρά μονοστρωματικά κυστίδια, (SUVs), για να μελετήσουμε τη σύνδεση της SFH8 με λιπίδια. Η SFH8 βρίσκεται στο φυτό Arabidopsisthaliana και εμπλέκεται στη μεταφορά λιπιδίων. Επίσης έχει αναφερθεί ότι αλληλεπιδράμε την πρωτεΐνη κινεσίνη από το σύμπλοκο KInesin-Separase (KISC). Αρχικά, ελέγξαμετη σύνδεση της SFH8 με τρία αρνητικά φορτισμένα λιπίδια και βρήκαμε ότι η σύνδεση δεν είναι ειδική για κανένα από αυτά. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η SFH8 συνδέεται με τις λιπιδικές μεμβράνες μέσω μη ειδικών ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων παρά μέσω αναγνώρισης ενός μοτίβου. Επιπλέον, η SFH8 έχει μια εγχενώς αποδιατεταγμένη περιοχή((IDR)) και τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι αυτή η περιοχή είναι πιθανότατα υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση της SFH8 με τις λιπιδικές μεμβράνες in vitro. Τέλος, επιβεβαιώνουμε την αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών SFH8/kinesin. Συνολικά, η τεχνική QCM-D αποδείχθηκε ένα ευέλικτο εργαλείο για τον σχεδιασμό βιοεπιφανειών με σκοπό να μελετήσουμε τις βιολογικές μεμβράνες και τις αλληλεπιδράσεις τους με πρωτεΐνες. Επιπλέον, τα συστήματα που μιμούνται μεμβράνες μπορούν εύκολα να τροποποιηθούν για τη μελέτη πρωτεΐνικών αλληλεπιδράσεων.