Σχεδιασμός και σύνθεση κιναζολινικών αναλόγων και αξιολόγηση της αντικαρκινικής και αντιικής τους δράσης

Abstract

Cancer represents the most frequent type of diseases and it is responsible for high morbidity and mortality rates, being the second cause of death annually with patient rates constantly increasing. There is an ongoing and compelling need for novel therapeutic agents to tailor personalized treatments and improve current survival rates. Among the vital molecular tools for the fight against cancer, the inhibition of protein kinases and ligases has been revealed as attractive target. Although many small molecules have shown success against various cases, the limited selectivity they present remains an obstacle to overcome. The quinazoline skeleton is one of the most frequently encountered in medicinal chemistry, with application in the design and synthesis of new compounds with therapeutic activity, due to the wide range of biological properties it; s derivatives present. These properties include anti-diabetic, antiviral, antibacterial, anti-cancer, around which the interest of this thesis is concentrated and others. Based on these data, in this doctoral thesis the goal is the development of new compounds with possible antitumor and derirable selective activity that carry the quinazoline ring, against various targets. Target molecules were the receptors with tyrosine kinase activity EGFR, C-MET and VΕGFR, as well as the kinases P38a and BRAF, while a new target emerged from the results of pharmacological evaluation, the tubulin tyrosine ligase (TTL). The new derivatives are categorized into 7 series of molecules and carry the quinazoline skeleton with two additional nitrogens in positions 6 and 8, while they are substituted in positions 4 and 7, where the type of substituent has a crucial role in the action of the molecules, directing it to a different target. The design was carried out with the help of molecular docking studies, but also data from the literature as well as evaluation of the results of pharmacological experiments on similar compounds of the laboratory's chemistry library. The synthesis of the new compounds started from commercially available ureas (thiourea, urea) or acetamidine and formamidine, while the final step involved the coupling of a substituted pyrimidine with the appropriately substituted aniline, which through an intramolecular cyclization and rearrangement mechanism produced the final desired products. In tandem, in silico structure-based virtual screening contributed in identifying the most promising hits, which were synthesized and optimized followed by in vitro pharmacological evaluation against cancer-cell lines and a panel of 100 proteins (DSF assay). In addition, crystallization trials (X-ray data collection and 3D structure determination) contributed on the design of more potent inhibitors. Many promising results came up, including P38a inhibition with IC50=6nm (patent pending), TTL inhibition with IC50=175 nM and IC50= 0.6-2.6 μΜ in 9 cell lines (LN-229, Capan-1, HCT-116, Hap-1, NCI-H460, DND-41, HL-60, K-562 and Z-138). According to literature this is one pf the most potent and selective inhibitors until now. Compounds of series I II, IV, V and VII are under pharmacological evaluation. The data collected from the pharmacological evaluation experiments of the new derivatives will be studied in order to safely draw conclusions on the optimization of their physicochemical characteristics and their binding affinity to the targets, with the aim of increasing their action and selectivity.

Ο καρκίνος αντιπροσωπεύει τη συχνότερη ασθένεια και είναι υπεύθυνος για πολύ υψηλά ποσοστά θνησιμότητας, αποτελώντας τη δεύτερη αιτία θανάτου ετησίως με τα ποσοστά των ασθενών να αυξάνονται συνεχώς. Υπάρχει μια συνεχής και επιτακτική ανάγκη για την εύρεση νέων θεραπευτικών παραγόντων και την προσαρμογή εξατομικευμένων θεραπειών με σκοπό τη βελτίωση των σημερινών ποσοστών επιβίωσης. Μεταξύ των ζωτικών μοριακών εργαλείων για την καταπολέμηση του καρκίνου, η αναστολή των λιγασών και των πρωτεϊνικών κινασών αποτελεί μία ελκυστική θεραπευτική προσέγγιση. Αν και πολλά μικρά μόρια έχουν δείξει επιτυχία σε διάφορες περιπτώσεις, η περιορισμένη εκλεκτικότητα που παρουσιάζουν παραμένει ένα εμπόδιο που πρέπει να ξεπεραστεί.Ο σκελετός της κιναζολίνης αποτελεί έναν από τους πιο συχνά απαντώμενους στη φαρμακευτική χημεία, με εφαρμογή στο σχεδιασμό και τη σύνθεση νέων ενώσεων με θεραπευτική δράση, λόγω του ευρέως φάσματος βιολογικών ιδιοτήτων που παρουσιάζουν τα παράγωγά της. Οι ιδιότητες αυτές περιλαμβάνουν την αντιδιαβητική, την αντιική, την αντιβακτηριακή και την αντικαρκινική, γύρω από την οποία συγκεντρώνεται το ενδιαφέρον της συγκεκριμένης διατριβής. Με βάση αυτά τα δεδομένα, στη διαδακτορική αυτή διατριβή στόχος είναι η ανάπτυξη νέων ενώσεων με πιθανή αντικαρκινική και επιθυμητή εκλεκτική δράση που φέρουν το δακτύλιο της κιναζολίνης, έναντι διαφόρων στόχων. Μόρια – στόχους αποτέλεσαν οι υποδοχείς με δράση κινάσης τυροσίνης EGFR, C-ΜΕΤ και VΕGFR, καθώς και οι κινάσες Ρ38α και BRAF, ενώ αναδείχτηκε από τα αποτελέσματα φαρμακολογικής αξιολόγησης και ένας νέος στόχος, η λιγάση τυροσίνης τουμπουλίνης (TTL). Τα νέα παράγωγα κατηγοριοποιούνται σε 7 σειρές μορίων και φέρουν το σκελετό της κιναζολίνης με δύο επιπλέον άζωτα στις θέσεις 6 και 8, ενώ είναι υποκατεστημένα στις θέσεις 4 και 7, όπου το είδος του υποκαταστάτη έχει κρίσιμο ρόλο στη δράση των μορίων, στρέφοντάς τη σε διαφορετικό στόχο. Ο σχεδιασμός διεξήχθη με τη βοήθεια μελετών μοριακής πρόσδεσης, αλλά και δεδομένων της βιβλιογραφίας καθώς και αξιολόγησης των αποτελεσμάτων φαρμακολογικών πειραμάτων παρόμοιων ενώσεων της χημειοθήκης του εργαστηρίου. Η σύνθεση των νέων ενώσεων ξεκίνησε από εμπορικά διαθέσιμες ουρίες (θειουρία, ουρία) ή ακεταμιδίνης και φορμαμιδίνης, ενώ το τελικό στάδιο περιλαμβάνει τη σύζευξη μιας υποκατεστημένης πυριμιδίνης με την κατάλληλα υποκατεστημένη ανιλίνη, οι οποίες μέσω ενός μηχανισμού ενδομοριακής κύκλωσης και μετάθεσης παράγουν τα τελικά επιθυμητά προϊόντα. Από τα νέα ανάλογα που συντέθηκαν, και μελετήθηκαν για τη φαρμακολογική τους δράση προέκυψαν πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα, συμπεριλαμβανομένης της αναστολής του P38α με IC50=6 nm (εκκρεμεί δίπλωμα ευρεσιτεχνίας) (Σειρά VI), της αναστολής της TTL με IC50=175 nM (Σειρά Ι), που σύμφωνα με τα μέχρι τώρα δεδομένα, αποτελεί έναν από τους πιο ισχυρό και εκλεκτικό αναστολέα αυτού του στόχου και κυτταροτοξικότητατς με IC50= 0,6-2,6 μΜ σε 9 κυτταρικές σειρές (LN-229, Capan-1, HCT-116, Hap- 1, NCI-H460, DND-41, HL-60, K-562 και Z-138) (Σειρά Ι). Επιπλέον ενδιαφέροντα και πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα in vitro (DSF assay) παρουσίασαν και οι ενώσεις της Σειράς ΙΙΙ για την BRAF κινάση, αλλά και για τις καρκινικές σειρές Τ24 και W2664, όπου το ποσοστό θνησιμότητας των κυττάρων συγκέντρωση σε 10 μΜ υπερέβαινε το 90%. Όσον αφορά τις ενώσεις των σειρών II, IV, V και VII, βρίσκονται υπό φαρμακολογική αξιολόγηση.Τα δεδομένα που θα συλλεχθούν από τα πειράματα φαρμακολογικών αξιολογήσεων των νέων παραγώγων θα μελετηθούν για την ασφαλή διεξαγωγή συμπερασμάτων για τη βελτιστοποίηση των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών και της συγγένειας πρόσδεσής τους στους στόχους, με σκοπό τη βελτιστοποίηση της δράσης και εκλεκτικότητάς τους.