Ο ρόλος της PCSK9 στην αθηροθρόμβωση

Abstract

Background-Purpose: PCSK9 is a serine protease which, in addition to its major role in endosomal and lysosomal degradation of the LDL receptor, which results in increased plasma LDL-cholesterol levels, exhibits several LDL receptor-independent actions on a variety of cell types, including platelets. Recent studies have demonstrated that PCSK9 is involved in the pathophysiology of inflammation and shows actions on other cell types, such as platelets, monocytes, etc. Materials-Methods: Initially, the interaction of PCSK9 with plasma lipoproteins was studied by isolating them by sequential ultracentrifugation and determining their PCSK9 levels by ELISA. At the same time, we studied the distribution of PCSK9 in HDL lipoprotein particles by the Lipoprint system and the form of PCSK9 present in each lipoprotein was determined by the Western blotting method. To investigate the effect of PCSK9 on thrombosis, we determined the levels of endogenous PCSK9 in washed platelets isolated from normolipidemic donors and also determined in washed platelets from hypercholesterolemic patients receiving monoclonal antibody against PCSK9. The effect of recombinant PCSK9 was studied both on the accumulation of washed platelets and on endothelial function in HUVECs endothelial cells in terms of membrane expression of ICAM-1 and secretion of MCP-1. In the above systems, the effect of bound PCSK9 on LDL and HDL lipoprotein was also studied using an antibody against PCSK9. To investigate possible pleiotropic actions of monoclonal antibodies administered against PCSK9, platelet aggregation of hypercholesterolemic patients in both PRP and washed platelets was studied before and after 4 doses of the antibody. In addition, in the PRP of the patients we determined the membrane expression of P-selectin and CD40L at the above two time points. We then determined in these patients the interactions of platelets with CD34+ precursor cells in whole blood by flow cytometry. Finally, we investigated the ability of both recombinant and HDL- and LDL-associated PCSK9 to angiogenesis through lumen formation in HUVECs cells.Results: Ultracentrifugally isolated lipoproteins contain PCSK9, indicating that due to ultracentrifugation a portion of PCSK9 is uncoupled from the lipoprotein particles. The distribution in HDL particles showed that S-HDL possesses more PCSK9 while in HDL both forms of PCSK9 (mature and furin-cleaved form) are present. The washed platelets of both patients and normolipidemics contain both forms of PCSK9 while endogenous PCSK9 does not affect platelet aggregation. Recombinant PCSK9 enhances platelet aggregation induced by thrombin and arachidonic acid while alone does not induce platelet aggregation. Also, LDL and HDL inhibit platelet aggregation. In addition, monoclonal antibodies against PCSK9 in patients receiving them did not statistically significantly modify platelet aggregation before and after the antibody in both PRP and washed platelets, as well as membrane expression of P-selectin and CD40L. However, washed platelets after antibody administration contain more PCSK9. In addition, in HUVECs endothelial cells PCSK9 enhances TNF-α-induced membrane expression of ICAM-1 as well as MCP-1 secretion. In parallel, LDL and HDL inhibited the membrane expression of ICAM-1 while in the presence of an antibody against PCSK9 this inhibition was statistical significantly reduced suggesting the involvement of PCSK9 of lipoproteins in this, whereas with respect to MCP-1 lipoproteins induced its secretion. Furthermore, recombinant PCSK9 enhanced lumen formation whereas HDL and LDL inhibited VEGF-induced lumen formation. Finally, in patients under monoclonal antibodies against PCSK9 there was an increase in the endothelial phenotype of CD34+ precursor cells and platelet interactions with CD34+ precursor cells. Conclusions: This PhD thesis shows that PCSK9 in addition to its classical role in LDL receptor degradation and LDL cholesterol increase in plasma, is involved in various mechanisms of atherothrombosis such as platelet aggregation, membrane expression of the adhesion molecule ICAM-1 and secretion of MCP-1, functions that demonstrate its contribution to thrombosis and inflammation, while it also displays angiogenic actions contributing to endothelial regeneration. Also, due to the lipoprotein particles containing PCSK9, the involvement of PCSK9 in atherosclerosis is also shown. In addition, our work demonstrated that monoclonal antibodies against PCSK9, in addition to their main role, are involved in the platelet functionality of patients and more fundamentally in the endothelial phenotype of CD34+ cells and their interactions with platelets.

Εισαγωγή- Σκοπός: Η PCSK9 είναι μια σερινο-πρωτεάση οποία εκτός από τον κύριο ρόλο της στην ενδοσωμική και λυσοσωμική αποικοδόμηση του υποδοχέα της LDL, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων της LDL-χοληστερόλης στο πλάσμα, παρουσιάζει αρκετές, ανεξάρτητες, από τον LDL υποδοχέα, δράσεις σε πληθώρα κυτταρικών τύπων, συμπεριλαμβανομένων των αιμοπεταλίων. Πρόσφατες μελέτες έχουν αποδείξει ότι η PCSK9 συμμετέχει στην παθοφυσιολογία της φλεγμονής και εμφανίζει δράσεις και σε άλλους κυτταρικούς τύπους, όπως αιμοπετάλια, μονοκύτταρα κ.α. Υλικά-Μέθοδοι: Αρχικά μελετήθηκε η αλληλεπίδραση της PCSK9 με τις λιποπρωτεΐνες του πλάσματος απομονώνοντας αυτές με τη μέθοδο των διαδοχικών υπερφυγοκεντρήσεων και προσδιορίζοντας τα επίπεδα τους σε PCSK9 με τη μέθοδο ELISA. Παράλληλα, μελετήσαμε την κατανομή της PCSK9 στα σωματίδια της HDL λιποπρωτεΐνης με το σύστημα Lipoprint ενώ η μορφή της PCSK9 που υπάρχει σε κάθε λιποπρωτεΐνη προσδιορίστηκε με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης (Western Blotting). Για να διερευνήσουμε τη δράση της PCSK9 στη θρόμβωση προσδιορίσαμε τα επίπεδα της ενδογενούς PCSK9 σε πλυμένα αιμοπετάλια που απομονώθηκαν από νορμολιπιδαιμικούς δότες ενώ προσδιορίστηκαν και στα πλυμένα αιμοπετάλια υπερχοληστερολαιμικών ασθενών που λάμβαναν μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της PCSK9. Η δράση της recombinant PCSK9 μελετήθηκε τόσο στη συσσώρευση πλυμένων αιμοπεταλίων όσο και στην ενδοθηλιακή λειτουργία σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVECs ως προς τη μεμβρανική έκφραση του ICAM-1 και την έκκριση της MCP-1. Στα παραπάνω συστήματα μελετήθηκε και η δράση της συνδεδεμένης PCSK9 στην LDL και HDL λιποπρωτεΐνη χρησιμοποιώντας αντίσωμα έναντι της PCSK9. Προκειμένου να διερευνήσουμε πιθανές πλειοτροπικές δράσεις των μονοκλωνικών αντισωμάτων που χορηγούνται έναντι της PCSK9, μελετήθηκε η συσσώρευση των αιμοπεταλίων των υπερχοληστερολαιμικών ασθενών τόσο στο PRP όσο και στα πλυμένα αιμοπετάλια πριν και μετά από 4 δόσεις του αντισώματος. Επιπλέον στο PRP των ασθενών προσδιορίσαμε τη μεμβρανική έκφραση της P-σελεκτίνης και του CD40L στις δύο παραπάνω χρονικές στιγμές. Στη συνέχεια, στους ασθενείς αυτούς προσδιορίσαμε τις αλληλεπιδράσεις των αιμοπεταλίων με τα CD34+ πρόδρομα κύτταρα σε ολικό αίμα με κυτταρομετρία ροής. Τέλος, διερευνήθηκε η ικανότητα τόσο της recombinant όσο και της συνδεδεμένης στην HDL και LDL PCSK9, στην αγγειογένεση μέσω του σχηματισμού αυλών σε κύτταρα HUVECs. Αποτελέσματα: Οι απομονωμένες υπερφυγοκεντρικά λιποπρωτεΐνες περιέχουν PCSK9, δείχνοντας ότι λόγω υπερφυγοκέντρησης ένα μέρος της PCSK9 αποσυνδέεται από τα λιποπρωτεϊνικά σωματίδια. Η κατανομή στα σωματίδια της HDL έδειξε ότι τα S-HDL διαθέτουν περισσότερη PCSK9 ενώ στην HDL υπάρχουν και οι δυο μορφές της PCSK9 (ώριμη και furin-cleaved μορφή). Τα πλυμένα αιμοπετάλια τόσο των ασθενών όσο και τον νορμολιπιδαιμικών διαθέτουν και τις δυο μορφές PCSK9 ενώ η ενδογενής PCSK9 δεν επηρεάζει την συσσώρευση των αιμοπεταλίων. H recombinant PCSK9 ενισχύει τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων που επάγεται από θρομβίνη και αραχιδονικό οξύ ενώ μόνη της δεν επάγει τη συσσώρευση. Επίσης, οι LDL και HDL αναστέλλουν τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων. Επιπλέον, τα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της PCSK9 σε ασθενείς που τα λαμβάνουν δεν τροποποιήσαν στατιστικά σημαντικά την συσσώρευση των αιμοπεταλίων πριν και μετά το αντίσωμα τόσο σε PRP όσο και σε πλυμένα αιμοπετάλια, καθώς επίσης και τη μεμβρανική έκφραση της P-σελεκτίνης και του CD40L. Όμως τα πλυμένα αιμοπετάλια μετά την χορήγηση του αντισώματος περιέχουν περισσότερη PCSK9. Επιπλέον, στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVECs η PCSK9 ενισχύει τη μεμβρανική έκφραση του ICAM-1 που επάγεται από τον TNF-α καθώς και την έκκριση της MCP-1. Παράλληλα, οι LDL και HDL ανέστειλαν τη μεμβρανική έκφραση του ICAM-1 ενώ παρουσία αντισώματος έναντι της PCSK9 η αναστολή αυτή μειώθηκε στατιστικά σημαντικά υποδηλώνοντας τη συμμετοχή της PCSK9 των λιποπρωτεϊνών σε αυτό, ενώ αναφορικά με την MCP-1 οι λιποπρωτεΐνες προκάλεσαν επαγωγή της έκκρισης του. Επιπλέον, η recombinant PCSK9 ενίσχυσε τη δημιουργία αυλών ενώ οι HDL και LDL ανέστειλαν τη δημιουργία αυλών που επάγεται από VEGF. Τέλος, στους ασθενείς υπό μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της PCSK9 υπήρξε αύξηση του ενδοθηλιακού φαινοτύπου των CD34+πρόδρομων κυττάρων και των αλληλεπιδράσεων των αιμοπεταλίων με τα CD34+ πρόδρομα κύτταρα. Συμπεράσματα: Η παρούσα διδακτορική διατριβή δείχνει ότι η PCSK9 πέραν του κλασσικού ρόλου της στην αποικοδόμηση του LDL υποδοχέα και την αύξηση της LDL χοληστερόλης στο πλάσμα, εμπλέκεται σε διάφορους μηχανισμούς αθηροθρόμβωσης όπως είναι η συσσώρευση των αιμοπεταλίων, η μεμβρανική έκφραση του μορίου προσκόλλησης ICAM-1 καθώς και η έκκριση της MCP-1, λειτουργίες που αποδεικνύουν την συμβολή της στη θρόμβωση και τη φλεγμονή, ενώ παράλληλα εμφανίζει και αγγειογενετικές δράσεις συμβάλλοντας στην ενδοθηλιακή αναγέννηση. Επίσης, λόγω των λιποπρωτεϊνικών σωματιδίων που διαθέτουν PCSK9 φαίνεται και η εμπλοκή της PCSK9 στην αθηροσκλήρωση. Επιπροσθέτως, η εργασία μας απέδειξε ότι τα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της PCSK9 πέραν του βασικού τους ρόλου, εμπλέκονται στη λειτουργικότητα των αιμοπεταλίων των ασθενών και βασικότερα στον ενδοθηλιακό φαινότυπο των CD34+ κυττάρων καθώς και στις αλληλεπιδράσεις τους με τα αιμοπετάλια.