Αξιοποίηση βακτηριακών γονιδίων hrp/hrc για την ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε αβιοτικές καταπονήσεις

Abstract

Plants’ exposure to unfavorable environments is extremely insecure for their productivity and survival, bringing about at the same time breeding schemes’-related appropriate adjustments, which aim at developing plant varieties resistant against stress factors as the most sustainable approach towards ensuring economic sustainability at a global level. Achieving resistance against stress factors is traditionally approached through selection of resistant genotypes and/or cross- transfer of resistant traits. Despite the unquestionable achievements of conventional breeding techniques, their effectiveness is limited by polygenic resistance traits, the existence of genotype-environment interaction, the need of large-scale evaluation of genotypes, the application of multiple cycle selection, as well as the difficulty in achieving uniform stress conditions at the field level. The above challenges are subjected to additional constraints regarding the narrow genetic base of crop species as well as the limited availability and the overexpression of utilized resistance sources, which inevitably affects resistance stability. In view of the necessity to expand the gene pool in order to achieve broad and stable resistance, research interest is justifiably turned to the exploitation of genetic engineering techniques which offer the possibility of targeted integration of a single favorable gene, regardless of origin and taxonomic barriers, offering opportunities of achieving of high-level resistance and/or immunity without further alteration of the target-organism. Given the limited availability of natural sources of plant-derived resistance, research increasingly incorporates the exploitation of non-plant origin genes that potentially confer broad spectrum resistance. The present dissertation aimed at deciphering the possibilities upon exploitation of bacterial hrp/hrc genes, which encode T3SS, to confer resistance against abiotic stresses. Firstly, the research focused on the investigation of hrpZPsph, hpaA and hpaB gene expression, which belong to hrp/hrc cluster, for the development of resistance against abiotic stresses. Following the finding that hrpZPsph-lines exhibit enhanced resistance against drought and salinity stress, the aim of the research was to decipher the mechanisms that govern the observed resistance, through the determination of plant metabolic profile under stress conditions and to find possible metabolic biomarkers that mark the metabolic adaptations under stress conditions. The introductory chapter describes the effects of stresses on plants as well as plant defense responses under abiotic and biotic stresses. A description of breeding approaches for the development of resistance against abiotic and biotic stresses follows, with an emphasis on genetic engineering techniques and the origin of utilized sources of resistance. Finally, a reference is made to the potential and prospects of the use of model plants in the fields of Plant Breeding. Given the multifaceted effects of harpins on plants, Chapter 2 investigates the possibility of exploitation of hrpZPsph gene from Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola to confer resistance against drought and salinity stress. The findings showed the prevalence of specific hrpZPsph-lines compared to wt plants, which at primary developmental stage was expressed through the enhanced seed germination and seedling growth potential, while at the vegetative state was reflected in the delayed and milder symptom development, the enhanced vigor, the higher survival rate and the recovery capacity after the period of stress. Overall findings indicate the positive effect of hrpZPsph gene to induce resistance against drought and salinity stress. Afterwards, the aim of the study was the response of hrpZPsph-lines under cadmium stress (Chapter 3) at the seedling stage and at later developmental stages. The findings support the conclusion that hrpZPsph-lines, namely lines #6 and #9 exhibit enhanced resistance against cadmium stress, as shown by the seed germination and seedling growth potential under stress conditions and the phenotypic and physiological response at the vegetative state. It is surprising that hrpZPsph-lines exhibited a differential cadmium accumulation pattern compared to wt plants. Specifically, wt plants displayed increased cadmium content in the leaves, whereas hrpZPsph-lines displayed an opposite accumulation trend, which possibly indicates the existence of a Cd retention mechanism within the roots. Given the multifaceted role of hrpZPsph in planta, which was reflected by the observed resistance against abiotic stresses, the research objective was the understanding of hrpZPsph-lines’ metabolic response under the above stresses and the discovery of metabolic components that play a key role in the induction of resistance. In chapter 4, a determination of plant metabolic profile is made as well as a comparative evaluation of hrpZPsph-lines and wt plants under drought stress conditions. Overall results underline the differential response of the studied genotypes under water stress conditions, which is primarily shown by the differences in metabolic content of line #6, identified as the most resistant to drought stress both at the seedling stage and mainly at the vegetative state. Furthermore, the study highlighted L-serine, L-threonine, mucic acid and pipecolic acid as key regulators under stress conditions. Considering that the differences in the accumulation trend of the above components correlated with the level of resistance of the studied genotypes, significant prospects are offered for their exploitation as biomarkers for the identification of resistant genotypes. By analogy, in Chapter 5 an approach to the study of the metabolic response of hrpZPsph-lines under salinity stress is adopted, with an aim to understand the mechanisms that govern the resistance of hrpZPsph-lines and to identify the components that signal the metabolic regulations under stress conditions. The results underline the discrete metabolic content of hrpZPsph-lines, compared to wt plants, both under normal and under stress conditions, providing evidence regarding the effect of hrpZPsph gene on the metabolism of N. benthamiana plants. Among hrpZPsph-lines, line #1 exhibited significant differentiation as to its metabolic content, which based on the evidence of Chapter 2 was identified as the most resistant to stress compared to other hrpZPsph-lines and wt plants both at the seedling stage and at the vegetative state. In relation to the components that signal the metabolic regulation under stress conditions, the significant contribution of D-galactose, L-proline, D-sorbitol, citric acid and malonic acid is underlined, providing prospects for their exploitation as resistance biomarkers against salinity stress. The resent study offers crucial knowledge regarding the effect of harpin ΗrpZPsph on the metabolic resistance response under drought and salinity stress, while contributing to the identification of metabolic components with key role in the metabolic regulation under stress conditions. In the framework of exploiting effector proteins to induce resistance against stress factors, the objective of Chapter 6 was the investigation of hpaA gene effect from Xanthomonas campestris pv. campestris, which based on its function has been proposed as effector as to the ability to induce resistance against stresses. For this purpose, the response of hpaA-transgenic Nicotiana benthamiana plants was studied under drought and salinity stress at the seedling stage and at the vegetative state. Overall results indicate the differential response of hpaA-lines and wt plants under drought and salinity stress and emphasize the superior performance of lines #1 and #5 over the others. The present study constitutes the first report regarding the effect of hpaA expression in planta, providing further evidence about the positive effect of effector expression on plants’ response against stress factors. Despite the inability to relate with known molecular and/or biochemical defense pathways, the observed increased resistance is possibly attributed to the induction of a general plant defense response due to the endogenous expression of hpaA gene and, in parallel, forms the basis for the further investigation regarding the effect of hpaA gene expression in planta. Given the role of HpaB protein on bacterial pathogenicity, as well as its function as a structural component of T3SS, the objective of Chapter 7 was the study of the functional effects of hpaB gene in planta, as to its ability to confer resistance against abiotic stresses. In particular, the response of hpaB-lines of N. benthamiana plants from Xanthomonas vesicatoria was studied under drought and salinity stress at the seedling stage and later developmental stages. The evidence clearly underline the superiority of line #4, reflected in all parameters studied, regarding the seed germination and seedling growth potential, the survival rate, the time and intensity of symptoms, the recovery capacity following normal irrigation, growth traits, the ability to retain water in the leaves and the chlorophyll and proline content. Although the mechanisms governing the observed resistance are not adequately supported, as this study consists the first report regarding the functional effect of hpaB gene in planta, the results offer significant prospects for the exploitation of hpaB gene to enhance resistance against stresses. Finally, General Discussion (Chapter 8) focuses on a review on the breeding approaches for the induction of resistance against stresses, with an emphasis on genetic engineering techniques. The results of the study are discussed in view of their contribution on acquiring basic knowledge and exploitation prospects in the research to induce resistance against stresses. General Discussion ends with a critical review of the new breeding techniques, which dramatically enrich breeders’ quiver in relation to their developmental rate and validation of effectiveness as well as the regulatory framework that is expected to define their scope for development and use of crop varieties with genetic resistance against stress factors.

Η έκθεση των φυτών σε δυσμενή περιβάλλοντα αποβαίνει εξαιρετικά επισφαλής για την παραγωγικότητα και ικανότητα επιβίωσής τους, επιφέροντας παράλληλα ανάλογες προσαρμογές στα προγράμματα βελτίωσης που στοχεύουν στην ανάπτυξη ποικιλιών με γενετική ανθεκτικότητα έναντι καταπονήσεων ως την πλέον βιώσιμη προσέγγιση για την εξασφάλιση της οικονομικής βιωσιμότητας των καλλιεργειών σε παγκόσμιο επίπεδο. Η επίτευξη ανθεκτικότητας έναντι καταπονήσεων προσεγγίζεται παραδοσιακά μέσω της επιλογής ανθεκτικών γονοτύπων ή/και της μεταφοράς γνωρισμάτων ανθεκτικότητας σε ευαίσθητους γονοτύπους μέσω διασταυρώσεων. Παρά τα αδιαμφισβήτητα επιτεύγματα των κλασικών βελτιωτικών διαδικασιών, η αποτελεσματικότητά τους περιορίζεται από τον πολυγονιδιακό έλεγχο των γνωρισμάτων ανθεκτικότητας, την ύπαρξη σημαντικής αλληλεπίδρασης γονοτύπου-περιβάλλοντος, την αναγκαιότητα αξιολόγησης ενός μεγάλου αριθμού γονοτύπων, την εφαρμογή πολλαπλών κύκλων επιλογής, καθώς και τη δυσκολία επίτευξης ομοιόμορφων συνθηκών καταπόνησης σε συνθήκες αγρού. Στις ανωτέρω προκλήσεις τίθενται πρόσθετοι περιορισμοί που σχετίζονται με τη στενή γενετική βάση των καλλιεργούμενων ειδών καθώς την περιορισμένη διαθεσιμότητα αλλά και υπερκέραση των χρησιμοποιούμενων πηγών ανθεκτικότητας που αναπόφευκτα πλήττει τη σταθερότητα της ανθεκτικότητας. Ενόψει της αναγκαιότητας διεύρυνσης της γονιδιακής δεξαμενής με στόχο την επίτευξη ευρείας και σταθερής ανθεκτικότητας, το ερευνητικό ενδιαφέρον στρέφεται δικαιολογημένα προς την αξιοποίηση των τεχνολογιών της γενετικής μηχανικής που δίνουν τη δυνατότητα στοχευμένης ένθεσης ενός μοναδικού επιθυμητού γονιδίου, ανεξαρτήτως προέλευσης και ταξινομικών εμποδίων, προσφέροντας δυνατότητες επίτευξης υψηλού επιπέδου ανθεκτικότητας ή/και ανοσίας χωρίς περαιτέρω αλλοίωση του οργανισμού -στόχου. Με δεδομένη την περιορισμένη διαθεσιμότητα φυσικών πηγών ανθεκτικότητας φυτικής προέλευσης, η έρευνα ενσωματώνει ολοένα και περισσότερο την αξιοποίηση γονιδίων μη φυτικής προέλευσης που δυνητικά προδίδουν ευρέος φάσματος ανθεκτικότητα. H παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στη διερεύνηση των δυνατοτήτων αξιοποίησης βακτηριακών γονιδίων hrp/hrc, που κωδικοποιούν το εκκριτικό σύστημα τύπου III (Τ3SS), για την ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε αβιοτικές καταπονήσεις. Αρχικά, η έρευνα εστίασε στη μελέτη της επίδρασης των γονιδίων hrpZPsph, hpaA και hpaB, που ανήκουν στη συστάδα hrp/hrc, ως προς τη δυνατότητα ανάπτυξης ανθεκτικότητας έναντι αβιοτικών καταπονήσεων. Έπειτα από τη διαπίστωση ότι οι hrpZPsph-σειρές εμφανίζουν προηγμένη ανθεκτικότητα έναντι των καταπονήσεων ξηρασίας και υψηλής αλατότητας, ως ερευνητικός στόχος τέθηκε η αποσαφήνιση των μηχανισμών που κυβερνούν την ανθεκτικότητά τους, μέσω προσδιορισμού του μεταβολικού τους προφίλ υπό συνθήκες καταπόνησης, και η εύρεση πιθανών μεταβολικών βιοδεικτών που σηματοδοτούν τις μεταβολικές προσαρμογές στις εν λόγω καταπονήσεις. Στο εισαγωγικό κεφάλαιο περιγράφονται οι επιπτώσεις που επιφέρουν οι καταπονήσεις στα φυτά καθώς και οι αποκρίσεις άμυνας των φυτών σε αβιοτικές και βιοτικές καταπονήσεις. Ακολούθως, γίνεται περιγραφή των βελτιωτικών προσεγγίσεων για την επίτευξη ανθεκτικότητας έναντι αβιοτικών και βιοτικών καταπονήσεων, με έμφαση στις τεχνολογίες της γενετικής μηχανικής και στη φύση των χρησιμοποιούμενων πηγών ανθεκτικότητας. Τέλος, γίνεται αναφορά στις δυνατότητες και προοπτικές που επιφέρει η αξιοποίηση φυτών-μοντέλων στα επιστημονικά πεδία της Βελτίωσης των Φυτών. Με δεδομένες τις πολυδιάστατες λειτουργικές επιδράσεις των χαρπινών στα φυτά, στο Κεφάλαιο 2 διερευνήθηκε η δυνατότητα αξιοποίησης του γονιδίου hrpZPsph, από το βακτήριο Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola, για την επίτευξη ανθεκτικότητας στις καταπονήσεις ξηρασίας και υψηλής αλατότητας. Τα ευρήματα από την αξιολόγηση κατέδειξαν την υπεροχή συγκεκριμένων hrpZPsph-σειρών έναντι των φυτών wt, η οποία στα νεαρά στάδια εκφράστηκε μέσω του υψηλότερου δυναμικού βλάστησης και ανάπτυξης των σποροφύτων, ενώ στο στάδιο των ώριμων φυτών αποτυπώθηκε στην καθυστερημένη ανάπτυξη και στην εκδήλωση ηπιότερων συμπτωμάτων, στη βελτιωμένη ευρωστία, στο υψηλότερο ποσοστό επιβίωσης αλλά και στην ικανότητα ανάκαμψης, μετά το πέρας της περιόδου καταπόνησης. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα υποδεικνύουν τη θετική επίδραση του γονιδίου hrpZPsph στην επαγωγή ανθεκτικότητας έναντι των καταπονήσεων ξηρασίας και υψηλής αλατότητας.Ακολούθως, αντικείμενο της μελέτης αποτέλεσε η απόκριση των hrpZPsph-σειρών στην καταπόνηση καδμίου (Κεφάλαιο 3) στη φάση της βλάστησης και σε μεταγενέστερα αναπτυξιακά στάδια. Τα ευρήματα συνηγορούν στο συμπέρασμα ότι οι hrpZPsph-σειρές, και ιδιαίτερα οι σειρές #6 και #9, εμφανίζουν προηγμένη ανθεκτικότητα έναντι της καταπόνησης καδμίου, όπως προκύπτει τόσο από το δυναμικό βλάστησης των σπόρων και ανάπτυξης των σποροφύτων υπό συνθήκες καταπόνησης όσο και από τη φαινοτυπική και φυσιολογική απόκριση στο στάδιο των ώριμων φυτών. Είναι ενδιαφέρον ότι οι hrpZPsph-σειρές εμφάνισαν διαφορετικό προφίλ συσσώρευσης καδμίου, συγκριτικά με τα φυτά wt. Ειδικότερα, τα φυτά wt εμφάνισαν μεγαλύτερη ποσότητα Cd στα φύλλα, ενώ οι hrpZPsph-σειρές παρουσίασαν αντίθετο μοτίβο, γεγονός που πιθανά υποδηλώνει την ύπαρξη ενός μηχανισμού συγκράτησης του Cd στις ρίζες. Με δεδομένο τον πολυδιάστατο ρόλο του hrpZPsph in planta, που αναδείχθηκε μέσω της παρατηρούμενης ανθεκτικότητας έναντι αβιοτικών καταπονήσεων, ερευνητικό στόχο αποτέλεσε η κατανόηση της μεταβολικής απόκρισης των hrpZPsph-σειρών στις ανωτέρω καταπονήσεις και ο εντοπισμός των μεταβολικών συστατικών με καίριο ρόλο στην επαγωγή ανθεκτικότητας. Στο Κεφάλαιο 4 έγινε προσδιορισμός του μεταβολικού προφίλ και συγκριτική αξιολόγηση των hrpZPsph-σειρών και των φυτών wt υπό συνθήκες καταπόνησης ξηρασίας. Τα συνολικά αποτελέσματα υπογραμμίζουν τη διαφορική απόκριση των υπό μελέτη γονοτύπων στην υδατική καταπόνηση, η οποία σημαίνεται πρωτίστως από τις διαφορές στο μεταβολικό περιεχόμενο της σειράς #6 που αναδείχθηκε ως η πλέον ανθεκτική στην ξηρασία κατά τη φάση της βλάστησης αλλά, κυρίως στο στάδιο των ώριμων φυτών. Επιπλέον, η έρευνα ανέδειξε ως βασικούς ρυθμιστές του μεταβολισμού υπό συνθήκες καταπόνησης τα συστατικά L-σερίνη, L- θρεονίνη, μουκικό οξύ και πιπεκολικό οξύ. Με δεδομένο ότι οι διαφορές στο προφίλ συσσώρευσης των ανωτέρω συστατικών σχετίστηκαν με το επίπεδο αντοχής των υπό μελέτη γονοτύπων, προσφέρονται σημαντικές προοπτικές αξιοποίησής τους ως βιοδείκτες για την αναγνώριση των ανθεκτικών γονοτύπων. Αντίστοιχα, στο Κεφάλαιο 5 προσεγγίστηκε η μελέτη της μεταβολικής απόκρισης των hrpZPsph-σειρών υπό συνθήκες καταπόνησης υψηλής αλατότητας με στόχο αφενός μεν την κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν την ανθεκτικότητα των hrpZPsph-σειρών και αφετέρου τον εντοπισμό των συστατικών που σηματοδοτούν τις μεταβολικές ρυθμίσεις υπό συνθήκες καταπόνησης. Τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν το διακριτό μεταβολικό περιεχόμενο των hrpZPsph-σειρών, συγκριτικά με τα φυτά wt, τόσο απουσία όσο και παρουσία καταπόνησης αλατότητας, παρέχοντας ενδείξεις σχετικά με την επίδραση του hrpZPsph στο μεταβολισμό των φυτών του είδους N. benthamiana. Μεταξύ των hrpZPsph-σειρών, σημαντική διαφοροποίηση ως προς το μεταβολικό περιεχόμενο εμφάνισε η σειρά #1, η οποία βάσει των ευρημάτων του Κεφαλαίου 2 αναδείχθηκε ως η πλέον ανθεκτική, στη φάση της βλάστησης και στο στάδιο των ώριμων φυτών, έναντι των υπολοίπων hrpZPsph-σειρών και των φυτών wt. Ως προς τα συστατικά που σηματοδοτούν τη ρύθμιση του μεταβολισμού υπό συνθήκες καταπόνησης, υπογραμμίζεται η σημαντική συνεισφορά των μεταβολιτών D-γαλακτόζη, L-προλίνη, D-σορβιτόλη, κιτρικό οξύ και μαλονικό οξύ, προσφέροντας δυνατότητες αξιοποίησής τους ως βιοδείκτες ανθεκτικότητας έναντι της καταπόνησης υψηλής αλατότητας. Η παρούσα μελέτη προσδίδει καίρια γνώση σχετικά με την επίδραση της χαρπίνης ΗrpZPsph στη μεταβολική απόκριση αντοχής στις καταπονήσεις ξηρασίας και υψηλής αλατότητας, συμβάλλοντας παράλληλα στον εντοπισμό των μεταβολικών συστατικών με πρωτεύοντα ρόλο στη ρύθμιση του μεταβολισμού υπό συνθήκες καταπόνησης. Στο πλαίσιο αξιοποίησης πρωτεϊνών-τελεστών για την επίτευξη ανθεκτικότητας έναντι καταπονήσεων, αντικείμενο του Κεφαλαίου 6 αποτέλεσε η διερεύνηση της επίδρασης του γονιδίου hpaA από το βακτήριο Xanthomonas campestris pv. campestris, το οποίο βάσει της δράσης του έχει προταθεί ως τελεστής, ως προς την ικανότητα επαγωγής ανθεκτικότητας έναντι καταπονήσεων. Στο πλαίσιο αυτό, μελετήθηκε η απόκριση hpaA-διαγονιδιακών φυτών του είδους Nicotiana benthamiana στην καταπόνηση ξηρασίας και υψηλής αλατότητας στη φάση της βλάστησης και στο στάδιο των ώριμων φυτών. Τα συνολικά ευρήματα υποδεικνύουν τη διαφορική απόκριση των hpaA-σειρών και των φυτών wt στις καταπονήσεις της ξηρασίας και της υψηλής αλατότητας και υπογραμμίζουν την υπερέχουσα επίδοση των σειρών #1 και #5 έναντι των υπολοίπων. Η παρούσα μελέτη συνιστά την πρώτη αναφορά σχετικά με την επίδραση της έκφρασης του hpaA in planta, παρέχοντας περαιτέρω ενδείξεις σχετικά με τη θετική επίδραση της έκφρασης τελεστών στην άμυνα των φυτών έναντι καταπονήσεων. Παρά την αδυναμία σύνδεσης με συγκεκριμένες μοριακές ή/και βιοχημικές οδούς άμυνας, η παρατηρηθείσα προηγμένη ανθεκτικότητα πιθανά αποδίδεται στην ενεργοποίηση της γενικής άμυνας των φυτών λόγω της ενδογενούς έκφρασης του γονιδίου hpaA και, παράλληλα, θέτει τη βάση για την περαιτέρω διερεύνηση της επίδρασης που φέρει η έκφραση του γονιδίου hpaA in planta.Με δεδομένο το ρόλο της πρωτεΐνης HpaB στην παθογένεια του βακτηριακού φορέα της, καθώς και τη δράση της ως δομικό συστατικό της εκκριτικής συσκευής T3SS, ερευνητικό στόχο του Κεφαλαίου 7 αποτέλεσε η μελέτη των λειτουργικών επιδράσεων του γονιδίου hpaB in planta, ως προς την ικανότητα επαγωγής ανθεκτικότητας έναντι αβιοτικών καταπονήσεων. Ειδικότερα, μελετήθηκε η απόκριση hpaB-σειρών του είδους N. benthamiana, από το βακτήριο Xanthomonas vesicatoria, στις καταπονήσεις ξηρασίας και υψηλής αλατότητας στη φάση της βλάστησης και σε μεταγενέστερα αναπτυξιακά στάδια. Τα ευρήματα υπογραμμίζουν σαφώς την υπεροχή της σειράς #4, η οποία εκφράστηκε σε όλες τις υπό μελέτη παραμέτρους που αφορούν στο δυναμικό βλάστησης και ανάπτυξης των σποροφύτων, στο ποσοστό επιβίωσης των φυτών, στο χρόνο εκδήλωσης και στην ένταση των συμπτωμάτων, στην ικανότητα ανάκαμψης έπειτα από άρδευση, σε αναπτυξιακά γνωρίσματα, στην ικανότητα συγκράτησης νερού στα φύλλα και στην περιεκτικότητα χλωροφύλλης και προλίνης. Αν και δεν παρέχεται επαρκής αιτιολόγηση σχετικά με τους μηχανισμούς που διέπουν την παρατηρηθείσα ανθεκτικότητα, καθώς η παρούσα μελέτη συνιστά την πρώτη αναφορά σχετικά με τη λειτουργική επίδραση του hpaB in planta, τα ευρήματα προσφέρουν προοπτικές αξιοποίησης του γονιδίου hpaΒ για την αναβάθμιση της ανθεκτικότητας έναντι καταπονήσεων. Τέλος, η Γενική Συζήτηση (Κεφάλαιο 8) επικεντρώνεται σε μία ανασκόπηση των βελτιωτικών προσεγγίσεων για την ανάπτυξη ανθεκτικότητας έναντι καταπονήσεων, δίδοντας έμφαση στις τεχνολογίες της γενετικής μηχανικής. Τα αποτελέσματα της μελέτης συζητώνται υπό το πρίσμα της συνεισφοράς τους στην απόκτηση βασικής γνώσης αλλά και των προοπτικών αξιοποίησής τους στην έρευνα για την ανάπτυξη ανθεκτικότητας έναντι καταπονήσεων. Η Γενική Συζήτηση ολοκληρώνεται με μία κριτική ανασκόπηση των νέων τεχνολογιών βελτίωσης, οι οποίες εμπλουτίζουν δραματικά τη φαρέτρα των βελτιωτών, σύμφωνα με το ρυθμό ανάπτυξής τους και τεκμηρίωσης της αποτελεσματικότητάς τους αλλά και του ρυθμιστικού πλαισίου που αναμένεται να καθορίσει το πλαίσιο εφαρμογής τους για ανάπτυξη και χρήση ποικιλιών με γενετική ανθεκτικότητα έναντι καταπονήσεων.