Protein-peptide analysis using the Omnitrap technology coupled to high-resolution mass spectometry: study of fragmentation mechanisms using a combination of dissociation techniques and applications on drug compounds

Abstract

This thesis presents a thorough study of protein and peptide fragmentation mechanisms in the gas phase by Mass Spectrometry (MS) using the novel segmented linear ion trap termed the OmnitrapTM platform. Multi-dimensional multiple-stage tandem processing of protein ions is demonstrated with superior efficiency, while the enhanced performance is enabled by incorporating a broad range of ion activation methods into a single platform in a highly dynamic fashion. The ion activation network explored here comprises external injection of reagent ions, VUV photons, variable energy electrons and collisions with neutral molecules. In-depth MSn characterization of proteins for both top-down and bottom-up workflows is performed, highlighting the unique capabilities of the Omnitrap platform.Chapter 1 provides the necessary theoretical background for complementing the material presented in subsequent chapters. Fundamental aspects of protein fragmentation in the gas phase and the different dissociation methods employed in mass spectrometry are briefly reviewed. Design features of the Omnitrap technology, as well as a new software tool - developed in Fasmatech - for top-down data analysis are also presented in the first chapter. Fasmatech is an instrument manufacturing company, where all experimental procedures described in this thesis were performed using their cutting-edge technology. One of the main objectives in this thesis is to demonstrate in-depth characterization of intact biomolecules by top-down MS, especially for the larger systems where utilization of a diverse set of ion activation methods can generate complementary information, enhancing sequence coverage and structural information. In Chapter 2, the capacity of the Omnitrap platform to empower top-down MS is established by the complete sequence coverage achieved for the medium-sized protein ubiquitin (8+ charge state) with four different fragmentation methods involving electrons, photons and reagent ions at the MS2 level. The degree of fragment pair complementarity accomplished in these experiments can only be approached by Ultraviolet Photodissociation (UVPD) (Shaw et al., 2013) and Activated Ion Electron Transfer Dissociation (AI-ETD) (Riley et al., 2017). A detailed analysis of the fragmentation channels observed in Hydrogen Ion Activated Dissociation (HIAD), a novel dissociation method employed for the first time with exceptional efficiency, is also presented in Chapter 2. The formation of radical protein ions by detachment of electrons leading to increased charge state species offers unique opportunities for investigating fundamental aspects of ion activation-dissociation processes. This is presented in Chapter 3 through a series of multiple-stage tandem MS experiments involving MS2 electron ionization of different charge states of ubiquitin and insulin chain B followed by MS3 collision induced dissociation (CID) of such hydrogen-deficient species. New series of fragments are identified and attributed to extensive intramolecular hydrogen atom rearrangement reactions initiated upon electron ionization and subsequent collisional activation. The extent of the rearrangement reactions appears to be charge-state dependent, providing enhancements in sequence coverage for most of the hydrogen-deficient species examined. Highly preferential radical dissociation pathways involving aromatic residues were observed suggesting that these residues are a preferential location for electron ionization to occur, drastically participating in radical hole migration processes and intramolecular H atom rearrangement reactions. Top-down MS3 CID of ionized proteins are contrasted to MS2 CID of the even-electron counterparts to highlight alterations in fragmentation pathways for species differing by one hydrogen atom only. A detailed summary of what is now considered to be the state-of-the-art in top-down MS for the characterization of an intact monoclonal antibody (mAb) in offline mode is provided in Chapter 4. A series of offline MS2, MS3 and MS4 experiments with intact non-reduced trastuzumab (Herceptin), ionized both under native and denaturing conditions and fragmented by a variety of dissociation methods including CID, electron induced dissociation (EID), electron capture dissociation (ECD), VUV photodissociation and HIAD, are presented, highlighting the unique capabilities of the Omnitrap technology. New standards in sequence coverage of intact mAbs are set by utilizing multidimensional multiple-stage MS4 workflows. The highest to the best of our knowledge sequence coverage of >80% obtained for the light chain released from intact non-reduced Herceptin is achieved by collisional activation at MS4 level of the charge-reduced light chain formed by electron capture. This particular MS4 workflow can be used both for de novo sequencing of the variable domain of monoclonal antibodies and for Quality Control (QC) purposes providing detailed information in terms of the disulfide bond network and possible scrambling. It is shown that both CID and ECD can be employed to reduce intermolecular SS bonds to release the light chain from intact mAbs, while collisionally activated ECD can be employed further to reduce intramolecular disulfide bonds in the gas phase. The results produced so far and presented here for intact mAbs by top-down MS highlight that complete sequence coverage of an intact mAb in an offline multiple-stage top-down experiment appears feasible. MS2 EID and MS2 HIAD spectra of intact antibodies are also generated for the first time. All top-down data sets were analyzed in Peak Finder, a new software platform whereby the deconvolution step is eliminated and advanced fitting algorithms are implemented specifically to accelerate manual processing of highly-congested mass spectra. The final Chapter 5 is dedicated to bottom-up workflows utilizing the electron-based dissociation methods available in the Omnitrap platform. A full set of Data Dependent Acquisition (DDA) MS2 experiments for the Bovine Serum Albumin digest (BSA) were performed with nano-liquid chromatography separation coupled to the Omnitrap Q Exactive HF MS platform using EID, ECD and Higher-energy C-trap dissociation (HCD) fragmentation methods. The BSA bottom-up data are compared at both protein and peptide level in terms of sequence coverage, number of peptide spectrum matches (PSMs), fragment ion complementarity, fragmentation patterns and w diagnostic ions using Fasmatech’s Proteome Discoverer (PD) extension software. It is demonstrated that electron-based dissociation methods provide higher sequence coverage and complementarity for the 3+ and 4+ peptide charge states and high-level differentiation between leucine and isoleucine residues through the formation of the w diagnostic ions, while high abundance fragments with side chain losses are identified in DDA MS2 EID. ExD (x = I, C) primary fragmentation pathways and neutral side-chain losses are also identified and discussed. Overall, the combination of the three fragmentation methods (EID, ECD and HCD) may provide complete sequence coverage for all the annotated peptides. The complementary character of the different fragmentation tools explored and highlighted herein can be exploited further to empower de novo bottom-up proteomics analysis. This is the first thesis providing a thorough overview of the different analytical workflows supported by the Omnitrap platform, highlighting the unique capabilities of the technology using a wide range of ion species and different ion dissociation methods. Furthermore, the combination of such a variety of fragmentation options in a single device qualifies the Omnitrap platform as an excellent tool for exploring the gas phase chemistry of ions across a wide mass range. The quality of the results produced and discussed here are enhanced further by connecting the Omnitrap platform to an OrbitrapTM mass analyzer.

Η παρούσα διατριβή παρουσιάζει μια διεξοδική μελέτη των μηχανισμών κατακερματισμού πρωτεϊνών και πεπτιδίων στην αέρια φάση με φασματομετρία μάζας (MS) χρησιμοποιώντας τη νέα τμηματοποιημένη γραμμική παγίδα ιόντων που ονομάζεται πλατφόρμα OmnitrapTM. Η πολυδιάστατη και πολλαπλών σταδίων διαδοχική επεξεργασία πρωτεϊνικών ιόντων επιδεικνύεται με υψηλή αποτελεσματικότητα, ενώ η βελτιωμένη απόδοση είναι δυνατή χάρη την ενσωμάτωση ενός ευρέος φάσματος μεθόδων ενεργοποίησης ιόντων σε μια ενιαία πλατφόρμα με εξαιρετικά δυναμικό τρόπο. Το δίκτυο ενεργοποίησης ιόντων που διερευνήθηκε περιλαμβάνει εξωτερική έγχυση ιόντων αντιδραστηρίων, φωτονίων VUV, ηλεκτρονίων μεταβλητής ενέργειας, καθώς και συγκρούσεις με ουδέτερα μόρια. Πραγματοποιείται εις βάθος MSn χαρακτηρισμός πρωτεϊνών τόσο για την «από πάνω προς τα κάτω», όσο και για την «από κάτω προς τα πάνω» προσέγγιση, υπογραμμίζοντας τις μοναδικές δυνατότητες της πλατφόρμας Omnitrap. Το Κεφάλαιο 1 παρέχει το απαραίτητο θεωρητικό υπόβαθρο, συμπληρωματικό στο υλικό που παρουσιάζεται στα επόμενα κεφάλαια. Οι θεμελιώδεις πτυχές του κατακερματισμού των πρωτεϊνών στην αέρια φάση και οι διαφορετικές μέθοδοι διάσπασης που χρησιμοποιούνται στη φασματομετρία μάζας ανασκοπούνται εν συντομία. Τα χαρακτηριστικά σχεδιασμού της τεχνολογίας Omnitrap, καθώς και ένα νέο λογισμικό - που αναπτύχθηκε στην εταιρία Fasmatech - για την ανάλυση «από πάνω προς τα κάτω» δεδομένων παρουσιάζονται επίσης στο πρώτο κεφάλαιο. Η Fasmatech είναι μια εταιρεία κατασκευής οργάνων, όπου πραγματοποιήθηκαν όλες οι πειραματικές διαδικασίες που περιγράφονται σε αυτή τη διατριβή, χρησιμοποιώντας την τεχνολογία αιχμής τους. Ένας από τους κύριους στόχους αυτής της διατριβής είναι να επιδείξει τον σε βάθος χαρακτηρισμό άθικτων βιομορίων μέσω της «από πάνω προς τα κάτω» MS, ειδικά για τα μεγαλύτερα συστήματα όπου η χρήση διαφορετικού συνόλου μεθόδων ενεργοποίησης ιόντων μπορεί να δημιουργήσει συμπληρωματικές πληροφορίες, ενισχύοντας την κάλυψη αλληλουχίας και τις δομικές πληροφορίες. Στο Κεφάλαιο 2, η ικανότητα της πλατφόρμας Omnitrap να ενισχύσει την «από πάνω προς τα κάτω» MS προσέγγιση αποδεικνύεται από την πλήρη κάλυψη αλληλουχίας που επιτυγχάνεται για την μεσαίου μεγέθους πρωτεΐνη ουμπικουιτίνη (8+ κατάσταση φόρτισης) σε MS2 επίπεδο με τέσσερις διαφορετικές μεθόδους κατακερματισμού που περιλαμβάνουν ηλεκτρόνια, φωτόνια και ιόντα αντιδραστηρίου. Ο βαθμός συμπληρωματικότητας των ζευγών ιοντικών θραυσμάτων που επιτυγχάνεται σε αυτά τα πειράματα μπορεί να προσεγγιστεί μόνο με την υπεριώδη φωτοδιάσπαση (UVPD) (Shaw et al., 2013) και τη διάσπαση μεταφοράς ηλεκτρονίων σε συνδυασμό με την ενεργοποίηση των ιόντων (AI-ETD) (Riley et al., 2017). Μια λεπτομερής ανάλυση των καναλιών κατακερματισμού που παρατηρούνται στην Διάσπαση μέσω ενεργοποίησης με ιόντα Υδρογόνου (HIAD), μια νέα μέθοδο διάστασης που χρησιμοποιείται για πρώτη φορά με εξαιρετική απόδοση, παρουσιάζεται επίσης στο Κεφάλαιο 2.Ο σχηματισμός πρωτεϊνικών ιόντων με ρίζα μέσω αποκόλλησης ηλεκτρονίων που οδηγεί σε αύξηση του επιπέδου φόρτισης προσφέρει νέες δυνατότητες στη διερεύνηση θεμελιωδών πτυχών των διεργασιών ενεργοποίησης-διάσπασης ιόντων. Ενδελεχής εξέταση των ανωτέρω παρουσιάζεται στο Κεφάλαιο 3 μέσω μιας σειράς διαδοχικών MS πειραμάτων πολλαπλών σταδίων που περιλαμβάνουν MS2 ιονισμό με ηλεκτρόνια της ουμπικουιτίνης και της αλυσίδας Β ινσουλίνης και MS3 διάσπαση μέσω συγκρούσεων (CID) των πρωτεϊνικών μορίων με έλλειψη υδρογόνου. Νέες σειρές θραυσμάτων εντοπίζονται και αποδίδονται σε εκτεταμένες ενδομοριακές αντιδράσεις αναδιάταξης ατόμων υδρογόνου που ξεκινούν με ιονισμό από ηλεκτρόνια και επακόλουθη ενεργοποίηση σύγκρουσης. Η έκταση των αντιδράσεων αναδιάταξης φαίνεται να εξαρτάται από την κατάσταση φόρτισης, βελτιώνοντας την κάλυψη αλληλουχίας για τα περισσότερα από τα μόρια με έλλειψη υδρογόνου που εξετάστηκαν. Παρατηρήθηκε αυξημένη προτίμηση σε οδούς διάσπασης ριζών που περιλαμβάνουν αρωματικά αμινοξέα, αναδεικνύοντας τα ως προτιμώμενη θέση για να συμβεί ιονισμός με ηλεκτρόνια, συμμετέχοντας δραστικά σε διαδικασίες μετανάστευσης των ριζών και σε αντιδράσεις ενδομοριακής αναδιάταξης ατόμων υδρογόνου. Το «από πάνω προς τα κάτω» MS3 CID των ιονισμένων πρωτεϊνών αντιπαραβάλλεται με το MS2 CID των ομολόγων τους με άρτιο αριθμό ηλεκτρονίων για να τονίσει τις μεταβολές στις οδούς κατακερματισμού για είδη που διαφέρουν μόνο κατά ένα άτομο υδρογόνου. Μια λεπτομερής σύνοψη αυτού που θεωρείται πλέον ως η τελευταία λέξη της τεχνολογίας στην «από πάνω προς τα κάτω» φασματομετρία μάζας για τον χαρακτηρισμό ενός άθικτου μονοκλωνικού αντισώματος (mAb) σε λειτουργία εκτός σύνδεσης παρέχεται στο Κεφάλαιο 4. Μια σειρά MS2, MS3 και MS4 εκτός σύνδεσης πειραμάτων με ανέπαφη μη ανηγμένη τραστουζουμάμπη (Herceptin), ιονισμένη τόσο σε φυσικές όσο και σε αλλοιωτικές (denaturing) συνθήκες και κατακερματισμένη με μια ποικιλία μεθόδων διάσπασης, όπως CID, διάσπαση επαγόμενη από ηλεκτρόνια (EID), διάσπαση με πρόσληψη ηλεκτρονίων (ECD), φωτοδιάσπαση VUV και HIAD. παρουσιάζονται, αναδεικνύοντας τις μοναδικές δυνατότητες της τεχνολογίας Omnitrap. Νέα πρότυπα στην κάλυψη της αμινοξικής ακολουθίας των άθικτων mAb ορίζονται με τη χρήση πολυδιάστατων πολλαπλών σταδίων MS4 πειραμάτων. Η υψηλότερη από όσο γνωρίζουμε κάλυψη αλληλουχίας >80% για την ελαφριά αλυσίδα που απελευθερώνεται από άθικτη μη ανηγμένη Herceptin επιτυγχάνεται με MS4 ενεργοποίηση μέσω συγκρούσεων της ελαφριάς αλυσίδας μειωμένου φορτίου που σχηματίζεται από πρόσληψη ηλεκτρονίων. Αυτή η συγκεκριμένη MS4 πειραματική ροή μπορεί να χρησιμοποιηθεί τόσο για de novo προσδιορισμό αλληλουχίας της μεταβλητής περιοχής μονοκλωνικών αντισωμάτων όσο και για σκοπούς Ποιοτικού Ελέγχου (QC) παρέχοντας λεπτομερείς πληροφορίες όσον αφορά στο δίκτυο δισουλφιδικών δεσμών και πιθανής αναδιάταξης τους. Αποδεικνύεται ότι τόσο το CID όσο και το ECD μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διάσπαση των διαμοριακών δισουλφιδικών δεσμών για την απελευθέρωση της ελαφριάς αλυσίδας από άθικτα mAbs, ενώ συνδυασμός των παραπάνω μεθόδων μπορεί να χρησιμοποιηθεί περαιτέρω για τη διάσπαση των ενδομοριακών δισουλφιδικών δεσμών στην αέρια φάση. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται για τα άθικτα mAbs με την «από πάνω προς τα κάτω» MS τονίζουν ότι η πλήρης κάλυψη ακολουθίας ενός ανέπαφου mAb σε ένα εκτός σύνδεσης «από πάνω προς τα κάτω» πείραμα πολλαπλών σταδίων φαίνεται εφικτή. Επιπλέον, φάσματα MS2 EID και MS2 HIAD άθικτων αντισωμάτων ελήφθησαν για πρώτη φορά. Όλα τα «από πάνω προς τα κάτω» δεδομένα αναλύθηκαν στο Peak Finder, μια νέα πλατφόρμα λογισμικού όπου το βήμα αποσυνέλιξης (deconvolution) εξαλείφεται και εφαρμόζονται προηγμένοι αλγόριθμοι ειδικά για την επιτάχυνση της χειροκίνητης επεξεργασίας φασμάτων μάζας με υψηλή συμφόρηση. Στο τελευταίο Κεφάλαιο 5 εξετάζεται η «από κάτω προς τα πάνω» προσέγγιση χρησιμοποιώντας τις μεθόδους διάσπασης με ηλεκτρόνια που είναι διαθέσιμες στην πλατφόρμα Omnitrap. Ένα πλήρες σύνολο MS2 πειραμάτων με εξαρτώμενη από τα δεδομένα ανάλυση (Data Dependent Acquisition, DDA) διεξήχθη για τη θρυψινοποιημένη λευκωματίνη ορού βοοειδών (BSA) με διαχωρισμό νανο-υγρής χρωματογραφίας σε συνδυασμό με την πλατφόρμα Omnitrap-Q Exactive HF MS χρησιμοποιώντας ως μεθόδους κατακερματισμού EID, ECD και υψηλότερης ενέργειας διάσπαση σε C-trap (HCD). Τα «από κάτω προς τα πάνω» δεδομένα BSA συγκρίνονται τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο πεπτιδίων όσον αφορά την κάλυψη αλληλουχίας, τον αριθμό αντιστοιχιών φάσματος πεπτιδίου (PSM), τη συμπληρωματικότητα ιοντικών θραυσμάτων, τα μοτίβα κατακερματισμού και τα w διαγνωστικά ιόντα χρησιμοποιώντας ένα νέο λογισμικό της Fasmatech ως επέκταση στο Proteome Discoverer (PD). Αποδεικνύεται ότι οι μέθοδοι διάσπασης που βασίζονται σε ηλεκτρόνια παρέχουν υψηλότερη κάλυψη αλληλουχίας και συμπληρωματικότητα για τα πεπτίδία με φορτίο 3+ και 4+ και υψηλά επίπεδα διαφοροποίησης μεταξύ λευκίνης και ισολευκίνης μέσω του σχηματισμού των διαγνωστικών ιόντων w, ενώ στο DDA MS2 EID προσδιορίζονται θραύσματα υψηλής αφθονίας με ουδέτερες απώλειες πλευρικής αλυσίδας. Τα μονοπάτια πρωτογενούς κατακερματισμού μέσω ExD (x = I, C) και οι απώλειες ουδέτερης πλευρικής αλυσίδας συζητούνται εις βάθος. Συνολικά, ο συνδυασμός των τριών μεθόδων κατακερματισμού (EID, ECD και HCD) μπορεί να παρέχει πλήρη κάλυψη αλληλουχίας για όλα τα αναγνωρισμένα πεπτίδια. Ο συμπληρωματικός χαρακτήρας των διαφορετικών εργαλείων κατακερματισμού που διερευνώνται μπορεί να αξιοποιηθεί περαιτέρω για την ενίσχυση της de novo «από κάτω προς τα πάνω» πρωτεωμικής ανάλυσης.