Ultrasonographic biomicroscopy of canine skin

Abstract

Traditionally, the diagnosis of skin diseases is based on history, clinical examination, laboratory test results and cutaneous histopathology. The continuous advancement in ultrasound has enabled this diagnostic imaging modality to be introduced in the evaluation of normal and diseased skin. The fact that ultrasonography is non-ionising and non-invasive makes it a useful tool aiding the diagnosis and monitoring of skin diseases.Based on the frequency employed, cutaneous ultrasonography can be classified as intermediate (7-15 MHz) or high-frequency (20 MHz or higher). Generally, frequencies more than 15 MHz are recommended to get a better resolution and to identify skin layers with higher clarity. Sedation is not normally required but it may be needed, occasionally, for an uncooperative dog. The skin should be shaved to improve contact between the transducer and the skin surface providing a better image and avoiding the creation of artifacts. The transducer is placed perpendicularly to the skin and minimal pressure should be applied. In some instances, skin saving may be avoided, and diagnostic images may be acquired with the use of copious amounts of ultrasound gel and steady pressure with the transducer.Cutaneous ultrasonography has been used in human dermatology to study normal skin echogenicity, thickness, and hydration status, as well as various pathologic conditions, including cutaneous or subcutaneous neoplasms, cysts, inflammatory lesions, post-radiation reactions, scleroderma, oedema, wounds, and presence of foreign bodies. Contrary to human medicine, there are only a few studies on the ultrasonography of canine skin, focusing on the evaluation of high frequency ultrasonography for the accurate measurement of skin thickness and for the evaluation of wound healing. The ultrasonographic and histologic measurements of normal canine skin thickness have been found to be significantly correlated, but the former were found to be substantially higher than the latter. This finding may be explained by the inevitable shrinkage of skin biopsy specimens during formalin fixation. Furthermore, in the previous studies, ultrasonographic examination included only one or four different sites of haired skin.The aim of our first study was to describe the echogenicity of normal canine haired skin using high-frequency (50 MHz) ultrasonography and to compare the ultrasonographic and the histologic measurement of skin thickness using snap-frozen biopsy samples. The study was performed on eight cutaneous sites of 10 clinically healthy, purpose-bred, Beagle dogs. The skin echogenicity was evaluated, and the mean of 10 measurements of skin thickness per site was calculated. Ultrasonography results were compared with histological appearance of skin cryosections stained with haematoxylin and eosin, as well as with the histometric measurement of skin thickness. Differences in the ultrasonographic and histologic measurements among biopsy sites, age and sex of the animals were examined. For the ultrasound examination, a portable ultrasound scanner (Episcan I-200; Longport Inc., Chadds Ford, PA, USA) with a 50 MHz transducer was used. The scanner was fitted with a polyvinylidene difluoride transducer incorporated into a probe filled with distilled water, and scanning was performed using a digital stepping motor. The axial resolution was expected to be ~50 μm. The focal zone of the transducer was set at 2 mm depth and the acquired images were 14.9 mm wide and 7.68 mm deep. Immediately after ultrasound biomicroscopy, the scanned areas were biopsied, using 8 mm disposable biopsy punches, without any additional preparation of the skin. One half of the biopsy sample was transferred into an embedding mould (Peel-A-WayR Molds; Polysciences Inc., Warrington, PA, USA) that was filled with optimal cutting compound (Tissue-Tek OCT compound; Miles Scientific, Fergus Falls, MN, USA), immersed in isopentane, cooled to its freezing point in liquid nitrogen and stored at -80°C until used. Five-micrometre-thick cryosections were stained with haematoxylin and eosin. The epidermis was identified as a thin, relatively nonuniform, hyperechoic linear layer. The dermis was hypoechoic to the epidermis and muscle fascia, and hyperechoic to the subcutaneous layer. The superficial dermis had a granular appearance more loosely arranged, with thin and irregularly distributed small echoes that probably arose from the collagen fibres. The deep dermis contained thicker linear echoes orientated more in parallel to the skin surface. The subcutaneous fat was visualized as an anechoic layer with sparse echogenicities. The muscle fascia, when visualized, appeared as linear, relatively thick echogenic lines orientated roughly parallel to the skin surface. The muscle below, when visible, appeared hypoechoic to the dermis and epidermis, and had equal to slightly higher echogenicity to the subcutaneous fat. The epidermis, dermis and subcutaneous fat corresponded to the same skin layers identified in the histologic sections. The hair follicles were regularly identified, and their appearance varied depending on the orientation of their axis in relationship to the ultrasound beam. When viewed along their long axis, they appeared as oblique, roughly tubular hypoechogenicities with faint echogenic linear areas at their margins, while when viewed in an oblique orientation they appeared as oblong hypoechogenicities, mildly irregular in outline. The fat around the root of the anagen hair follicles appeared as a ‘cloudy’ hypoechogenicity with indistinct margination. Furthermore, there was a highly significant, positive association between ultrasonographic and histologic measurements of skin thickness. There were no significant differences between sex, age or among the different examination sites, for both ultrasonographic and histological skin thickness measurements.In conclusion, this study showed that cutaneous high-frequency ultrasound biomicroscopy using a 50 MHz transducer was a useful tool to identify the skin layers (epidermis, dermis, and subcutaneous fat), to demonstrate the hair follicles and to measure the thickness of normal canine haired skin.In the second study, we attempted, for the first time, to apply ultrasound biomicroscopy for the examination of the skin of dogs with atopic dermatitis. The aims were a) to compare high-frequency ultrasonographic findings among lesional skin of dogs with atopic dermatitis, their macroscopically non-lesional skin, and the macroscopically non-lesional skin of healthy dogs; b) to examine for possible correlations between ultrasonographic findings in lesional skin and local Canine Atopic Dermatitis Extent and Severity Index-4 (CADESI-4) or its domains (erythema, lichenification, and excoriations/alopecia), and c) to examine if ultrasonographic findings change in parallel with local CADESI-4 or its domains during treatment of atopic dermatitis. Twenty privately-owned dogs with atopic dermatitis sensu lato and fulfilling at least 6 out of 8 of the first set of diagnostic criteria proposed by Favrot and co-workers (2010) comprised the atopic dermatitis group (six of them before and after treatment). Six healthy, privately-owned dogs, with an age of more than 6 months, no evidence of dehydration, and no cutaneous or systemic diseases were included in the healthy group. The same portable ultrasound machine and probe, as in the previous study, was used to scan 10 skin sites in all dogs. All scans were evaluated by the PhD student who was blinded to the group the animal and to the part of the body the scanned image was from. Wrinkling of skin surface, presence and width of subepidermal low echogenic band, hypoechogenicity of dermis, and thickness of the skin were evaluated and scored or measured blindly.This study confirmed the findings from the previous study that a thin, relatively non-uniform area that corresponds to the epidermis, followed by relatively hypoechoic dermis can be identified using a 50MHz transducer. In addition to the normal non-lesional skin, this general ultrasonographic appearance was also evident in the lesional and the non-lesional skin of dogs with atopic dermatitis. Based on the results of this study we concluded that: (i) dermal hypoechogenicity was more common and more severe in the lesional compared to non-lesional skin of dogs with atopic dermatitis; (ii) in the lesional skin of dogs with atopic dermatitis the presence and the severity of wrinkling of skin surface and of dermal hypoechogenicity were positively correlated with the presence and with the severity of lichenification, whereas the severity of dermal hypoechogenicity was positively correlated with local CADESI-4; and (iii) there is a positive correlation between the changes in skin thickness, as measured by ultrasound biomicroscopy, and the changes in the severity of local erythema during diagnostic and therapeutic interventions for atopic dermatitis that did not include the administration of anti-inflammatory drugs. These results showed that high-frequency ultrasound biomicroscopy has the potential to be useful for the evaluation of the skin of dogs with atopic dermatitis and of its changes during treatment.

Παραδοσιακά, η διάγνωση των δερματοπαθειών στηρίζεται στο ιστορικό, στα ευρήματα της κλινικής εξέτασης και των εργαστηριακών εξετάσεων και, όταν χρειάζεται, στην ιστοπαθολογική εξέταση των βιοψιών από το δέρμα. Οι συνεχείς τεχνολογικές εξελίξεις στο χώρο της υπερηχοτομογραφίας έχουν επιτρέψει τη χρήση αυτής της απεικονιστικής μεθόδου για την εξέταση του φυσιολογικού δέρματος αλλά και διάφορων δερματοπαθειών. Το γεγονός ότι η υπερηχοτομογραφία δεν χρησιμοποιεί ιονίζουσα ακτινοβολία και δεν είναι επεμβατική, την κάνει δυνητικά χρήσιμο εργαλείο για τη διάγνωση και την παρακολούθηση της θεραπείας διάφορων δερματοπαθειών.Με βάση την κάθε φορά χρησιμοποιούμενη συχνότητα του υπερήχου, η υπερηχοτομογραφία του δέρματος διακρίνεται στην ενδιάμεσης (7-15 MHz) και την υψηλής (≥20 MHz) συχνότητας. Γενικά, προτιμάται η χρήση συχνοτήτων μεγαλύτερων από 15 MHz, προκειμένου να υπάρχει ικανοποιητική ευκρίνεια της εικόνας και να είναι εφικτή η διαφοροποίηση μεταξύ των στοιβάδων του δέρματος. Συνήθως δε χρειάζεται χημική συγκράτηση (εκτός από τη, σχετικά σπάνια, περίπτωση ζώων που δε συνεργάζονται), αλλά καλό είναι να κουρεύεται το δέρμα της περιοχής που πρόκειται να εξεταστεί, προκειμένου να υπάρχει καλύτερη επαφή μεταξύ του ηχοβολέα και της επιδερμίδας και κατά συνέπεια καλύτερη απεικόνιση και αποφυγή τεχνουργημάτων. Εναλλακτικά, τα αποτελέσματα της εξέτασης μπορεί να είναι διαγνωστικά χωρίς να προηγηθεί κούρεμα, με τη χρήση μεγάλης ποσότητας υπερηχοτομογραφικής γέλης και τη διατήρηση σταθερής πίεσης του δέρματος από τον ηχοβολέα καθ’ όλη την εχέταση. Σε κάθε περίπτωση, ο τελευταίος τοποθετείται κάθετα στην επιφάνεια του δέρματος στην οποία και ασκεί ελάχιστη πίεση.Η υπερηχοτομογραφική εξέταση έχει χρησιμοποιηθεί στον άνθρωπο για τη μελέτη της απεικόνισης του φυσιολογικού δέρματος, του πάχους και του βαθμού ενυδάτωσής του, καθώς και διάφορων δερματοπαθειών, όπως, για παράδειγμα, των νεοπλασμάτων του δέρματος και του υποδόριου ιστού, των κύστεων, διάφορων δερματιτίδων, της δερματοπάθειας μετά από ακτινοθεραπεία, του σκληροδέρματος, του οιδήματος του δέρματος, των τραυμάτων και της παρουσίας ξένων σωμάτων. Αντίθετα, στην Κτηνιατρική δεν υπάρχουν παρά ελάχιστες σχετικές μελέτες, όπου η υπερηχοτομογραφία υψηλής συχνότητας χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση του πάχους του δέρματος και την εκτίμηση της επούλωσης των τραυμάτων. Αν και οι υπερηχοτομογραφικές και ιστολογικές μετρήσεις του πάχους του δέρματος σχετίζονταν σημαντικά μεταξύ τους, οι πρώτες ήταν συστηματικά μεγαλύτερες από τις δεύτερες, πιθανά λόγω της συρρίκνωσης των βιοψιών του δέρματος κατά τη μονιμοποίησή τους στη φορμόλη. Επιπλέον, στις προηγούμενες μελέτες η υπερηχοτομογραφική εξέταση πραγματοποιήθηκε μόνο σε μια ή σε τέσσερεις διαφορετικές ανατομικές περιοχές του δέρματος.Ο στόχος της πρώτης από τις μελέτες μας ήταν να περιγράψουμε την ηχογένεια του φυσιολογικού δέρματος του σκύλου με τη χρήση υπερηχοτομογράφου υψηλής συχνότητας (50 MHz) και να συγκρίνουμε το πάχος του δέρματος μεταξύ των μετρήσεων με την παραπάνω εξέταση και εκείνων σε ιστοτεμάχια που καταψύχθηκαν αμέσως μετά τη βιοψία, χωρίς να μονιμοποιηθούν σε φορμόλη. Χρησιμοποιήθηκαν 10 κλινικά υγιή πειραματόζωα, φυλής beagle και εξετάσθηκαν οκτώ ανατομικές περιοχές του δέρματος από κάθε σκύλο, στις οποίες εκτιμήθηκε η υπερηχοτομογραφική απεικόνιση του δέρματος και του υποδόριου ιστού και μετρήθηκε το πάχος του δέρματος (διάμεσος 10 μετρήσεων/ανατομική περιοχή της απόστασης από την επιδερμίδα μέχρι το όριο χορίου-υποδόριου ιστού). Τα ιστοτεμάχια βάφτηκαν με αιματοξυλίνη-εωσίνη και χρησιμοποιήθηκαν για να ερμηνευθεί η υπερηχοτομογραφική εικόνα του δέρματος και να συγκριθούν οι μετρήσεις του πάχους του. Τα αποτελέσματα ελέγχθηκαν για τυχόν διαφορές μεταξύ των ανατομικών περιοχών, μεταξύ των δύο φύλων ή μεταβολών που σχετίζονταν με την ηλικία των σκύλων. Χρησιμοποιήθηκε φορητός υπερηχοτομογράφος (Episcan I-200; Longport Inc., Chadds Ford, PA, USA) με ηχοβολέα 50 MHz. Ο σαρωτής ήταν συνδεδεμένος με μετατροπέα από διφθορίδιο του πολυβινυλιδενίου που ήταν ενσωματωμένος σε μορφοτροπέα που γέμιζε με απεσταγμένο νερό, ενώ η σάρωση του δέρματος έγινε με ψηφιακό κινούμενο ενισχυτή. Η αξονική διακριτική ικανότητα ήταν της τάξης των 50 μm, η εστιακή ζώνη του μετατροπέα ορίστηκε σε βάθος 2 mm και οι εικόνες που ανακτήθηκαν είχαν πλάτος 14,9 mm και βάθος 7,68 mm. Αμέσως μετά την υπερηχοτομογραφική εξέταση, χωρίς να γίνει χειρουργική προετοιμασία του δέρματος, λαμβάνονταν βιοψίες, από τα ίδια ακριβώς σημεία, με διατρητή μίας χρήσης διαμέτρου 8 mm. Τα ιστοτεμάχια κόβονταν κάθετα ως προς την επιδερμίδα και μεταφέρονταν σε ειδικούς μεταλλικούς υποδοχείς (Peel-A-WayR Molds; Polysciences Inc., Warrington, PA, USA) που αρχικά γεμίζονταν με optimal cutting compound (Tissue-Tek OCT compound; Miles Scientific, Fergus Falls, MN, USA) και στη συνέχεια ψύχονταν σε ισοπεντάνιο, που είχε παγώσει στο σημείο τήξης του ύστερα από εμβάπτιση σε υγρό άζωτο. Τα παγωμένα ιστοτεμάχια διατηρούνταν στους -80°C μέχρι να χρησιμοποιηθούν για την παρασκευή τομών, πάχους 5 μm, σε κρυοτόμο που στη συνέχεια βάφονταν με αιματοξυλίνη-εωσίνη. Η επιδερμίδα απεικονίστηκε ως λεπτή, σχετικά ανομοιογενής, υπερηχογενής γραμμοειδής στοιβάδα. Το χόριο του δέρματος απεικονιζόταν υποηχογενές σε σύγκριση με την επιδερμίδα και τις περιτονίες των μυών και υπερηχογενές σε σύγκριση με τον υποδόριο ιστό. Οι περισσότερο επιφανειακές στοιβάδες του χορίου εμφανίζονταν κοκκώδεις με λιγότερο πυκνές τοπικές εστίες μικρών ήχων, με λεπτές και ανώμαλα κατανεμημένες ακουστικές ανακλάσεις που πιθανότατα αναπαριστούσαν τις ίνες του κολλαγόνου. Αντίθετα, στα βαθύτερα στρώματα του χορίου, υπήρχαν παχύτερες γραμμικές ανακλάσεις με διάταξη περισσότερο παράλληλη προς την επιφάνεια του δέρματος. Το υποδόριο λίπος απεικονίζονταν ως ανηχογενής στοιβάδα με σποραδικές εστίες υπερηχογένειας. Οι μυϊκές περιτονίες, όταν απεικονίζονταν, ήταν γραμμικές και σχετικά παχιές ηχογενείς δομές με διάταξη σχετικά παράλληλη ως προς την επιφάνεια του δέρματος. Οι υποκείμενοι μύες, όταν απεικονίζονταν, ήταν υποηχογενείς σε σύγκριση με το χόριο και την επιδερμίδα και εξίσου ή περισσότερο ηχογενείς σε σύγκριση με τον υποδόριο ιστό. Η επιδερμίδα, το χόριο και ο υποδόριος ιστός, όπως απεικονίστηκαν με την υπερηχοτομογραφική εξέταση, αντιστοιχούσαν στις ίδιες στοιβάδες του δέρματος όπως αυτές φαίνονταν στα ιστοτεμάχια. Επιπλέον, με την υπερηχοτομογραφική εξέταση απεικονίστηκαν οι θύλακες των τριχών, η εικόνα των οποίων διέφερε ανάλογα με τον προσανατολισμό του επιμήκη άξονά τους σε σύγκριση με εκείνον του υπερήχου. Όταν απεικονίζονταν κατά τον επιμήκη άξονά τους, οι θύλακες εμφανίζονταν ως σχετικά σωληνοειδείς, υποηχογενείς κατασκευές με αχνές ηχογενείς γραμμικές περιοχές στα όριά τους. Αντίθετα, όταν ο προσανατολισμός τους ήταν λοξός, εμφανίζονταν ως επιμήκεις υποηχογενείς δομές με σχετικά ανώμαλο περίγραμμα. Το υποδόριο λίπος γύρω από το κατώτερο τμήμα των αναγονικών θυλάκων απεικονίζονταν ως θολερή υποηχογενής δομή με ασαφή όρια. Τέλος, διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντικός συσχετισμός μεταξύ της υπερηχοτομογραφικής και της ιστολογικής μέτρησης του πάχους του δέρματος, το οποίο δε διάφερε ανάμεσα στις οκτώ ανατομικές περιοχές ή μεταξύ των αρσενικών και θηλυκών σκύλων και δεν σχετιζόταν με την ηλικία τους. Συμπερασματικά, η μελέτη αυτή έδειξε ότι η υψηλής συχνότητας (50 MHz) υπερηχοτομογραφική εξέταση, επιτρέπει τη διάκριση των στοιβάδων του δέρματος (επιδερμίδα, χόριο, υποδόριος ιστός), απεικονίζει τους θυλάκους των τριχών και επιτρέπει την αξιόπιστη μέτρηση του πάχους του δέρματος. Στη δεύτερη μελέτη χρησιμοποιήσαμε, για πρώτη φορά, την υπερηχοτομογραφική εξέταση για να μελετήσουμε το δέρμα σκύλων με ατοπική δερματίτιδα. Οι στόχοι της μελέτης ήταν: α) η σύγκριση των ευρημάτων αφενός του δέρματος σκύλων με ατοπική δερματίτιδα που εμφάνιζε μακροσκοπικές αλλοιώσεις, και του δέρματος των ίδιων σκύλων σε περιοχές όπου δε εμφανίζει μακροσκοπικές αλλοιώσεις και αφετέρου του δέρματος των υγιών σκύλων, β) η διερεύνηση για τυχόν συσχετισμούς μεταξύ των ευρημάτων της υπερηχοτομογραφικής εξέτασης και της βαρύτητας των δερματικών αλλοιώσεων στην αντίστοιχη περιοχή του δέρματος, όπως αυτή βαθμολογήθηκε με την κλίμακα Canine Atopic Dermatitis Extent and Severity Index-4 (CADESI-4) ή συσχετισμών μεταξύ των ευρημάτων της υπερηχοτομογραφικής εξέτασης και των επιμέρους δερματικών αλλοιώσεων (ερύθημα, λειχηνοποίηση, δρυφάδες/αλωπεκία) που περιλαμβάνονται στην κλίμακα CADESI-4, και γ) η διερεύνηση τυχόν συσχετισμών μεταξύ των μεταβολών των ευρημάτων της υπερηχοτομογραφικής εξέτασης και των μεταβολών της κλίμακας CADESI-4 ή των επιμέρους δερματικών αλλοιώσεων στη διάρκεια της θεραπευτικής αντιμετώπισης της ατοπικής δερματίτιδας. Στην ομάδα των σκύλων με ατοπική δερματίτιδα συμπεριλήφθηκαν 20 σκύλοι ιδιοκτητών, που πληρούσαν τουλάχιστον 6 από τα 8 διαγνωστικά κριτήρια κατά Favrot και συν. (2010), ενώ οι έξι από τους 20 αυτούς σκύλους ελέγχθηκαν πριν και μετά τη θεραπεία. Στην ομάδα των υγιών σκύλων συμπεριλήφθηκαν έξι κλινικά υγιείς σκύλοι ιδιοκτητών, ηλικίας άνω των 6 μηνών. Η υπερηχοτομογραφική εξέταση έγινε σε 10 ανατομικές περιοχές του δέρματος με τον ίδιο υπερηχοτομογράφο, όπως στην πρώτη μελέτη, και οι εικόνες εξετάστηκαν από τον υποψήφιο διδάκτορα, ο οποίος δεν γνώριζε την ανατομική περιοχή ή την ομάδα του σκύλου στην οποία αντιστοιχούσε η κάθε εικόνα. Βαθμολογήθηκαν ή μετρήθηκαν η ρυτίδωση της επιφάνειας του δέρματος, η παρουσία και το πλάτος της υποεπιδερμικής υποηχογενούς ζώνης, η υχοδομή του χορίου και το πάχος του δέρματος.Στη μελέτη αυτή επιβεβαιώθηκαν τα ευρήματα της προηγούμενης έρευνας όσον αφορά την απεικόνιση του δέρματος (επιφανειακά η λεπτή, σχετικά ανομοιογενής επιδερμίδα και από κάτω το σχετικά υποηχογενές χόριο), όχι μόνο στο δέρμα των υγιών σκύλων αλλά και σε εκείνο των σκύλων με ατοπική δερματίτιδα, με ή χωρίς μακροσκοπικές αλλοιώσεις. Τα σημαντικότερα ευρήματα της μελέτης είναι: α) το χόριο του δέρματος σκύλων με ατοπική δερματίτιδα που εμφανίζει μακροσκοπικές αλλοιώσεις απεικονίζεται με μειωμένη ηχογένεια συχνότερα και εντονότερα σε σύγκριση με το δέρμα των ίδιων ζώων σε περιοχές χωρίς μακροσκοπικές αλλοιώσεις, β) στο δέρμα των σκύλων με ατοπική δερματίτιδα και μακροσκοπικές αλλοιώσεις η παρουσία και ή ένταση της ρυτίδωσης της επιφάνειας του δέρματος και της υποηχογένειας του χορίου σχετίζονταν σημαντικά με την παρουσία και την ένταση της λειχηνοποίησης και επιπλέον, η μείωση της ηχογένειας του χορίου σχετιζόταν με το CADESI-4 στην ίδια περιοχή του δέρματος, και γ) υπήρχε θετικός συσχετισμός μεταξύ της μεταβολής του πάχους του δέρματος και της μεταβολής της έντασης του ερυθήματος ύστερα από την εφαρμογή διάφορων διαγνωστικών και θεραπευτικών μέτρων για την ατοπική δερματίτιδα, που δεν περιλάμβαναν τη χορήγηση φαρμάκων με αντιφλεγμονώδη δράση. Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι η υπερηχοτομογραφία υψηλής συχνότητας είναι χρήσιμη στη μελέτη των αλλοιώσεων του δέρματος σκύλων με ατοπική δερματίτιδα και των μεταβολών τους κατά τη διάρκεια της θεραπείας.