Η επίδραση της υποξίας στους μηχανισμούς επιβίωσης και απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων: ο ρόλος του συμπλόκου HIF-1α-μορταλίνης

Abstract

Hypoxia is defined as a decrease in the available oxygen levels observed in cells or tissues and is characteristic of many physiological (e.g., high altitude and intense muscle exercise) and pathological conditions (e.g., ischemia, cancer). HIF-1 plays a major role in regulating the cell response to hypoxia acting as a transcription factor. Furthermore, its activity has been correlated with promotion of cancer cell survival and apoptosis inhibition in different cancer types. HIF-1 is a heterodimer, consisting of a constantly expressed subunit, HIF-1β or ARNT, and a HIF-1α subunit, the expression of which is regulated by a post-translational modification (hydroxylation) and subsequent degradation. However, HIF-1α affects various cellular functions also through mechanisms independent of its transcriptional activity, via interacting with proteins other than ARNT. As it has been previously demonstrated by the Laboratory of Biochemistry, the subcellular localization of HIF-1α along with its protein interactions are regulated through ERK1/2 kinase-mediated phosphorylation of amino acid residues Ser641/Ser643. When HIF-1α is modified at these sites, it is concentrated inside the nucleus, where it interacts with nucleophosmin (NPM1) and activates the transcription of its target genes as a response to low oxygen levels. On the other hand, lack of phosphorylation at Ser641/Ser643, results in the interaction of HIF-1α with the exportin CRM1 and its export from the nucleus into the cytoplasm, where it interacts with mortalin, which mediates its targeting to the mitochondria and the formation of a complex which inhibits apoptosis initiation.In the context of characterizing the HIF-1α-mortalin interaction, recombinant fragments of the two proteins were used for in vitro binding assays and immunoprecipitation experiments to map the corresponding binding sites and demonstrate that their interaction is direct and functional. More specifically, it was shown that the C-terminal domain of mortalin binds specifically and directly with non-phosphorylated ΗΙF-1α. We could also show that embelin, a natural product and known inhibitor of the mortalin-p53 interaction, could block assembly of the mortalin-HIF-1a complex and, furthermore, remove unmodified HIF-1α from the mitochondria. Embelin-induced dissociation of non-phosphorylated HIF-1α from the mitochondrial outer membrane, leads to translocation of the pro-apoptotic protein B-cell lymphoma 2-associated X protein (Bax) at the mitochondria, under stress conditions. In summary, our results prove that, under hypoxia and ERK1/2 kinase inactivation conditions, the direct and specific binding between mortalin and HIF-1α inhibits mitochondrial targeting of Bax and protects cells from cell death through apoptosis.

Ως υποξία ορίζεται η ελάττωση των διαθέσιμων επιπέδων οξυγόνου που παρατηρείται σε κύτταρα ή ιστούς και είναι χαρακτηριστικό πολλών φυσιολογικών (π.χ. μεγάλο υψόμετρο και έντονη μυϊκή άσκηση) και παθολογικών καταστάσεων (π.χ. ισχαιμία, καρκίνος). Ο HIF-1 αποτελεί μεταξύ άλλων, την κύρια πρωτεΐνη, που ρυθμίζει την απόκριση των κυττάρων στην υποξία, κυρίως μέσω της δράσης του ως μεταγραφικός παράγοντας. Επιπλέον, η δράση του έχει συσχετιστεί με προώθηση της επιβίωσης και αναστολή της απόπτωσης σε διάφορους καρκίνους. Ο ΗΙF-1 είναι ετεροδιμερές αποτελούμενος από μία υπομονάδα που εκφράζεται συνεχώς, την HIF-1β ή ARNT, και από την υπομονάδα HIF-1α, η έκφραση της οποίας ρυθμίζεται οξυγονο-εξαρτώμενα μέσω μετα-μεταφραστικής τροποποίησης (υδροξυλίωσης) και αποικοδόμησης. Ωστόσο ο HIF-1α επιδρά σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες και μέσω μηχανισμών ανεξάρτητων από τη μεταγραφική του δράση, αλληλεπιδρώντας με άλλες πρωτεΐνες εκτός του ARNT. Από προηγούμενες δημοσιεύσεις του εργαστηρίου Βιοχημείας, δείχθηκε ότι η υποκυτταρική κατανομή και οι αλληλεπιδράσεις του HIF-1α με άλλες πρωτεΐνες, ρυθμίζονται μέσω φωσφορυλίωσης από τις κινάσες ERK1/2 στα κατάλοιπα Ser641/Ser643. Όταν ο HIF-1α τροποποιείται σε αυτές τις θέσεις, συγκεντρώνεται στο εσωτερικό του πυρήνα, όπου αλληλεπιδρά με την νουκλεοφοσμίνη (NPM1) και ενεργοποιεί τη μεταγραφή των γονιδίων-στόχων του. Η απώλεια της φωσφορυλίωσης στις θέσεις 641 και 643, έχει ως αποτέλεσμα την αλληλεπίδραση του HIF-1α με την εξπορτίνη CRM1 και την εξαγωγή του από τον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα, όπου αλληλεπιδρά με τη μορταλίνη, η οποία διαμεσολαβεί τη στόχευση του στα μιτοχόνδρια και την συγκρότηση ενός συμπλόκου που αναστέλλει την έναρξη της απόπτωσης.Κύριο θέμα της παρούσας διατριβής αποτέλεσε ο χαρακτηρισμός της αλληλεπίδρασης μεταξύ HIF-1α και μορταλίνης. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν, τόσο πειράματα in vitro δέσμευσης, χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένα τμήματα των δύο πρωτεϊνών, όσο και ανοσοκατακρήμνισης, ώστε να χαρτογραφηθούν οι αντίστοιχες θέσεις δέσμευσης μεταξύ τους και να δειχθεί ότι η αλληλεπίδραση είναι άμεση και λειτουργική. Συγκεκριμένα αποδείχθηκε ότι η καρβοξυτελική επικράτεια της μορταλίνης δεσμεύεται άμεσα και εξειδικευμένα με τον μη φωσφορυλιωμένο HIF-1α. Επίσης, δείχθηκε ότι ένα φυσικό παράγωγο, που ονομάζεται εμπελίνη και είναι γνωστός αναστολέας της αλληλεπίδρασης μεταξύ της μορταλίνης και της p53, μπορεί να αναστείλει την αλληλεπίδραση μορταλίνης/HIF-1α και να οδηγήσει σε απομάκρυνση του μη φωσφορυλιωμένου HIF-1α από τα μιτοχόνδρια. Η επαγόμενη από την εμπελίνη, απομάκρυνση του μη φωσφορυλιωμένου HIF-1α από την εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη οδηγεί στη μετακίνηση της προ-αποπτωτικής πρωτεΐνης Bax (B-cell lymphoma 2-associated X protein) στα μιτοχόνδρια, κάτω από συνθήκες στρες. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι σε συνθήκες υποξίας και απενεργοποίησης των ERK1/2, η άμεση και ειδική δέσμευση μεταξύ της μορταλίνης και του HIF-1α, παρεμποδίζει τη στόχευση της Bax στα μιτοχόνδρια και προστατεύει τα κύτταρα από κυτταρικό θάνατο μέσω απόπτωσης.