Υγρή βιοψία-μοριακή διάγνωση καρκίνου: ανάπτυξη μεθόδων ανάλυσης κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων και αντίστοιχου ctDNA και κλινική αξιολόγηση της ετερογένειάς τους στον καρκίνο μαστού

Abstract

Liquid biopsy is a minimally invasive approach that provides important information regarding the tumor progression through the analysis of peripheral blood allowing real-time monitoring of the patient. Liquid biopsy is mainly based on the analysis of circulating tumor cells (CTCs) and extracellular tumor DNA (ctDNA). The analysis of single CTCs provides the possibility to elucidate the various mechanisms underlying the heterogeneity of cancer cells within the patient as well as those of tumor progression. The detection of mutations in liquid biopsy samples (ctDNA and CTCs) requires highly sensitive techniques due to the low frequency of mutated alleles in the total wild-type background.In the present PhD thesis, we initially developed and analytically validated a novel, highly sensitive and specific ESR1-NAPA assay for the detection of four ESR1 mutations (Y537S, Y537C, Y537N and D538G). The ESR1-NAPA assay is based on the combination of: (a) a NaME-PrO step to eliminate the wild-type DNA, (b) an ARMS-PCR step for detection of the four ESR1 mutations separately, and 3) a real-time PCR-melting curve analysis step. The assay was further applied in ER+ breast cancer (BrCa) primary tumour tissues (FFPEs), non-cancerous breast tissues (mammoplasties), and pairs of liquid biopsy samples (CTCs and paired plasma-ctDNA) obtained at different time points from 8 ER+ metastatic breast cancer patients. In the plasma-ctDNA, ESR1 mutations were not identified at the baseline, whereas the D538G mutation was detected during the follow-up period at five consecutive time points in one patient. In the CTCs, only the Y537C mutation was detected in one patient sample at the baseline. A direct comparison of the ESR1-NAPA assay with the drop-off ddPCR using 32 identical plasma ctDNA samples gave a concordance of 90.6%.Furthermore, we performed for the first time a comprehensive liquid biopsy analysis for 13 patients all diagnosed with early breast cancer, based on a long-term follow-up. Our analysis was based on CTC enumeration, CTC phenotypic characterization and molecular monitoring of CTCs at the gene expression, DNA mutation and DNA methylation level, and on corresponding plasma cell-free DNA for DNA mutation and DNA methylation markers. Our results indicate that a comprehensive liquid biopsy analysis provides valuable and important information for the therapeutic management of breast cancer patients since it is a unique way to shed light into the black box that was sealed till now between the information taken from the primary tumor and from a distant metastatic site. Our results demonstrate that liquid biopsy analysis could reveal the presence of MRD years before the appearance of clinically detectable metastatic disease and progression of disease.In addition, a novel drop-off ddPCR assay, the Dual-drop-off ddPCR methodology, was developed and analytically validated for the simultaneous screening of mutations in exons 9 and 20 of the PIK3CA gene. The analytical validation of the methodology was followed by its clinical application to plasma-cfDNA samples of patients with ER+ metastatic breast cancer. A comparison study was performed with previously developed methodologies based on the combination of allele-specific ARMS-PCR and melting curve analysis.In the last part of the present PhD thesis, a novel multimarker methodology was developed and validated for the simultaneous detection of PIK3CA and ESR1 mutations based on the Multiplex PCR-coupled liquid bead array technology (Luminex system). This methodology was first validated using cancer cell lines and then was applied to single CTCs isolated from CellSearch® cartridges through the VyCAP punching system.

Η υγρή βιοψία (liquid biopsy) αποτελεί μία ελάχιστα επεμβατική προσέγγιση η οποία παρέχει σημαντικές πληροφορίες σχετικές με την εξέλιξη του όγκου μέσω της ανάλυσης του περιφερικού αίματος επιτρέποντας την παρακολούθηση του ασθενούς σε πραγματικό χρόνο. Η υγρή βιοψία βασίζεται κυρίως στην ανάλυση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (Circulating Tumor Cells, CTCs) και του εξωκυττάριου καρκινικού DNA (circulating tumor DNA, ctDNA). Η ανάλυση μονήρων CTCs (single CTCs) παρέχει τη δυνατότητα να αποσαφηνιστούν οι διάφοροι μηχανισμοί στους οποίους οφείλεται η ετερογένεια των καρκινικών κυττάρων στον ίδιο ασθενή καθώς και της εξέλιξης του όγκου. Η ανίχνευση μεταλλάξεων σε δείγματα υγρής βιοψίας (ctDNA και CTCs) αποτελεί μία πρόκληση καθώς απαιτεί εξαιρετικά ευαίσθητες τεχνικές λόγω της παρουσίας του πολύ χαμηλού ποσοστού μεταλλαγμένων αλληλίων στο σύνολο των φυσιολογικών.Στην παρούσα διατριβή, αρχικά αναπτύχθηκε μία εξαιρετικά ευαίσθητη και ειδική μεθοδολογία για την ανίχνευση τεσσάρων ESR1 μεταλλάξεων σε δείγματα ασθενών με ER+ μεταστατικό καρκίνο μαστού. Η μεθοδολογία αυτή που ονομάσαμε ESR1-NAPA βασίζεται στον συνδυασμό του ΝaME-PrO, της αλληλοειδικής ARMS-PCR και της ανάλυσης καμπυλών τήξης. Την αναλυτική επικύρωση ακολούθησε η κλινική εφαρμογή της μεθόδου αναλύοντας δείγματα DNA που απομονώθηκαν από ιστούς παραφίνης, CTCs και αντίστοιχο πλάσμα 8 ασθενών με ER+ μεταστατικό καρκίνο μαστού. Τα αποτελέσματα έδειξαν την ανίχνευση ESR1 μετάλλαξης σε διαδοχικά δείγματα εξωκυττάριου DNA (cell-free DNA, cfDNA) μιας ασθενούς ενώ δεν εντοπίστηκαν οι ESR1 μεταλλάξεις στα πρώτα δείγματα cfDNA των ασθενών πριν την έναρξη της θεραπείας. Τα αποτελέσματα της μελέτης επικυρώθηκαν με την μεθοδολογία της drop-off ddPCR, καταγράφοντας υψηλή συμφωνία (90,6%) μεταξύ των δυο μεθοδολογιών χρησιμοποιώντας 32 δείγματα cfDNA.Στη συνέχεια, διεξήχθη μια πολυπαραμετρική μελέτη υγρής βιοψίας για την έγκαιρη διάγνωση της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου (minimal residual disease, ΜRD) στον καρκίνο μαστού. Για τη μελέτη αυτή, αναλύθηκαν διαδοχικά δείγματα από 13 ασθενείς που όλες διαγνώστηκαν με πρώιμο καρκίνο του μαστού και τα οποία ελήφθησαν κατά τη διάρκεια μακροχρόνιας παρακολούθησης. Η εν λόγω ανάλυση βασίστηκε στην καταμέτρηση των CTCs, το φαινοτυπικό και μοριακό χαρακτηρισμό τους καθώς και την ανάλυση ctDNA. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι μια πολυπαραμετρική ανάλυση υγρής βιοψίας παρέχει πολύτιμες και σημαντικές πληροφορίες για τη θεραπευτική αντιμετώπιση των ασθενών με καρκίνο μαστού, καθώς είναι μία διαδικασία που μπορεί να ρίξει φως στο κενό που μεσολαβεί μεταξύ των πληροφοριών που λαμβάνονται από τον πρωτοπαθή όγκο και από μια μακρινή μεταστατική εστία. Η συγκεκριμένη μελέτη κατέδειξε τη σημασία της ανάλυσης υγρής βιοψίας στην αποκάλυψη της παρουσίας MRD χρόνια πριν από την εμφάνιση κλινικά ανιχνεύσιμης μεταστατικής νόσου και υποτροπής.Επιπλέον, στα πλαίσια της συγκεκριμένης διατριβής αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μία νέα μεθοδολογία drop-off ddPCR, η Dual-drop-off ddPCR, για την ταυτόχρονη ανίχνευση παρουσίας μεταλλάξεων στα εξώνια 9 και 20 του γονιδίου PIK3CA. Την αναλυτική επικύρωση της μεθοδολογίας ακολούθησε η εφαρμογή της σε δείγματα υγρής βιοψίας και συγκεκριμένα σε δείγματα cfDNA πλάσματος ασθενών με ER+ μεταστατικό καρκίνο μαστού. Ακολούθησε σύγκριση των αποτελεσμάτων της αναπτυχθείσας μεθοδολογίας με εκείνων των προηγούμενων αναπτυχθέντων μεθοδολογιών που βασίζονται στο συνδυασμό της αλληλοειδικής ARMS-PCR και της ανάλυσης καμπυλών τήξης.Στο τελευταίο μέρος της διατριβής, αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μία μεθοδολογία για την ταυτόχρονη ανίχνευση μεταλλάξεων των γονιδίων PIK3CA και ESR1 με αξιοποίηση της τεχνολογίας των υγρών μικροσυστοιχιών σφαιριδίων (σύστημα Luminex). Η εν λόγω μεθοδολογία αρχικά αξιολογήθηκε μέσω καρκινικών κυτταρικών σειρών και κατόπιν εφαρμόστηκε σε δείγματα μονήρων CTCs που απομονώθηκαν από τα CellSearch® cartridges μέσω του συστήματος VyCAP.