Δομικές μελέτες DNA μεθυλτρανσφερασών

Abstract

DNA methylation plays a major role in epigenetic regulation in almost all organisms, from bacteria to plants and higher eukaryotes, revealing multifaceted roles for the enzymes that are responsible for this modification, DNA methyltransferases. DNA MTases are involved in gene expression, cell cycle regulation, and bacterial adaptation to different environmental stimuli as they transfer methyl groups to a target DNA base from their cofactor AdoMet, forming AdoHcy and methylated DNA.M.BseCI is an N6-adenine MTase that methylates the N6 atom of the 3’ adenine in the sequence 5’-ATCGAT-3’ and is part of a type II restriction-modification system of the gram-positive thermophilic bacterium Geobacillus stearothermophilus, commonly found in soil and hot springs. The M.BseCI DNA MTase is a type II N6mA-MTase of 579 amino acids, appearing as a monomer with a molecular weight of 66.7 kDa, with an optimal temperature for enzyme activity at 323-328 °K and a pH of 7.4.In the present study, we performad the biochemical characterization and structural study of M.BseCI in complex with its target DNA in different methylation forms as a basis for understanding the structure and mechanism of action of N6-adenine DNA MTases. Unlike C5-cytosine MTases, very few crystal structures of N6 adenine MTases have been solved in complex with DNA, and therefore little is known about their catalytic mechanism and structural features involved in DNA binding, base flipping, and AdoMet cofactor binding. Specifically, the expression and isolation of M.BseCI were performed, as well as the formation and biochemical characterization of its complexes with its cofactor AdoHcy and its target DNA in different methylation forms (unmethylated (UM), hemimethylated (HM), and fully methylated (FM)). Subsequently, crystallization experiments of these protein complexes were conducted, followed by the determination of their three-dimensional structures using X-ray crystallography. The structures were determined using molecular replacement and optimized to a resolution of 2.4 Å for the complex with hemimethylated DNA and 2.6 Å for the complex with fully methylated DNA.The protein appears divided into 2 domains, connected by a loop, forming a cavity within which the DNA oligonucleotide target is located. The N-terminal domain (residues 1-301) is a mixed α/β structure consisting of a twisted 10-strand β-sheet surrounded by α-helices approximately parallel to the β-strands. This configuration is known as the MTase fold and is conserved in many other MTases. The MTase fold begins with the αA α-helix and continues with alternating parallel β-strands and α-helices, with the exception of an antiparallel β-strand (β7) that follows β6. In the case of M.BseCI, its N-terminal domain consists of 2 additional α-helices and an additional 3-strand antiparallel β-sheet accompanied by an α-helix. The remaining residues of M.BseCI constitute the C-terminal domain of the protein (aa 302-579), which lacks such extensive secondary structure. The structural analysis of M.BseCI confirms that certain features of γ-N6-DNA adenine MTases are evidently conserved across all their members. M.BseCI, like M.TaqI, flips the target adenine 180° out of the DNA double helix into a cavity forming its active site, located in its N-terminal domain. While the N-terminal domain exhibits amino acid, structural, and functional conservation, there are significant differences in the C-terminal domain responsible for much of the target sequence recognition. Despite these expected differences due to the variation in the recognition sequence of each protein, a general structural homology and residue correspondence involved in the target DNA recognition of the enzymes in the two C-terminal domains is observed, which is not evident when observing the amino acid sequence. Even assuming that the sequences methylated by M.BseCI and M.TaqI are similar, as they contain the common core 5'-TCGA-3', justifying the similarities in their C-terminal regions, in the case of the orphan γ-N6-adenine DNA MTase CamA, with a recognition sequence of 5’-CAAAAA-3’, this is not the case, and yet the conservation of structural elements and specific interactions is even greater. These three MTases also exhibit similar distortion of the DNA backbone during the flipping of the target adenine out of the double helix. The significant compression of the backbone around the adenine, the absence of amino acids in the vacant position, and the lack of changes in the pairing of the remaining bases are phenomena so far observed only in γ-N6-adenine DNA MTases. However, the mechanism by which adenine flipping occurs has not been fully elucidated, nor has the mechanism of pushing the adenine back into the double helix after methylation. Another significant feature of DNA methylation is the ability of DNA MTases to distinguish the methylation state of their DNA substrates, among those that have methyl groups on one strand (hemimethylated DNA) and those that have not undergone methylation. In the structure of both M.BseCI complexes, base flipping appears to occur regardless of the methylation state of the adenine, corresponding to previous studies on the C5 cytosine MTase M.HhaI with an abasic nucleotide bound at the target site, which showed that the enzyme flips the phosphosugar backbone out of the DNA helix. It is therefore likely that base flipping is not promoted by the base to be methylated itself, but by the DNA backbone. Another parameter of methylation that has not been fully decoded in prokaryotic organisms is the selection of the correct DNA orientation by the MTase in symmetrical recognition sequences, so that the daughter strand of the newly synthesized DNA, which remains unmethylated after replication, is methylated. In the case of M.BseCI, a small hydrophobic platform around the already methylated adenine A17 on the other DNA strand suggests that the already methylated adenine guides the enzyme's binding in the correct orientation on hemimethylated DNA sequences carrying its recognition sequence. While such a mechanism seems likely and effective, it does not appear to be present in the M.TaqI complex, and further structural and biochemical studies are needed to fully document it.In conclusion, the structural study of M.BseCI both in the absence of DNA and with oligonucleotides carrying its recognition sequence in each methylation form represents an important step towards further elucidating the mechanism of N6-adenine DNA methylation, a process catalyzed by a large family of enzymes with multifaceted roles across the spectrum of organisms.

Η μεθυλίωση του DNA επιτελεί αποτελεί σημαντικό παράγοντα επιγενετικής ρύθμισης, σε σχεδόν όλους τους οργανισμούς, από τα βακτήρια έως τα φυτά και τους ανώτερους ευκαρυώτες. αποκαλύπτοντας πολυδιάστατους ρόλους για τα ένζυμα που την πραγματοποιούν, τις DNA μεθυλτρανσφεράσες. Οι DNA ΜΤασες εμπλέκονται στην γονιδιακή έκφραση, την ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και την προσαρμογή των βακτηρίων σε διαφορετικά περιβαλλοντικά ερεθίσματα. Οι DNA ΜΤασες μεταφέρουν μεθυλομάδες στην αζωτούχο βάση του DNA από τον συμπαράγοντα τους AdoMet, προς σχηματισμό AdoHcy και μεθυλιωμένου DNA.Η M.BseCI αποτελεί μια N6-adenine ΜΤαση που μεθυλιώνει το Ν6 άτομο της 3’ αδενίνης στην αλληλουχία 5’-ATCGAT-3’και αποτελεί μέρος ενός τύπου ΙΙ συστήματος περιορισμού-τροποποίησης του gram-θετικού θερμόφιλου βακτηρίου Geobacillus stearothermophilus, που συνήθως συναντάται στο έδαφος και σε θερμές πηγές. Η M.BseCI DNA ΜΤαση είναι μια τύπου ΙΙ N6mA-ΜΤαση 579 αμινοξέων, που εμφανίζεται ως μονομερές μοριακού βάρους 66.7 kDa, με ιδανική θερμοκρασία για την δραστικότητα του ενζύμου τους 323-328 οΚ και pH 7.4.Στην παρούσα διδακτορική έρευνα, πραγματοποιήθηκε ο βιοχημικός χαρακτηρισμός και η δομική μελέτη της M.BseCI σε σύμπλοκο με το DNA στόχο της σε διαφορετικές μορφές μεθυλίωσης , ως βάση για την κατανόηση των δομών και του μηχανισμού δράσης των DNA ΜΤασων Ν6-μεθυλαδενίνης. Σε αντίθεση με τις C5-cytosine ΜΤασες, ελάχιστες κρυσταλλικές δομές N6 adenine ΜΤασων έχουν λυθεί σε σύμπλοκο με DNA και συνεπώς λίγα είναι γνωστά σχετικά με τον καταλυτικό τους μηχανισμό και τα δομικά τους χαρακτηριστικά που εμπλέκονται στην πρόσδεση του DNA, στο base flipping και στην πρόσδεση του συμπαράγοντα AdoMet. Συγκεκριμένα, έλαβε χώρα έκφραση και απομόνωση της M.BseCI, καθώς και ο σχηματισμός και βιοχημικός χαρακτηρισμός συμπλόκων της πρωτεΐνης με τον συμπαράγοντα της AdoHcy και το DNA- στόχο της σε διαφορετικές μορφές μεθυλίωσης (μη μεθυλιωμένο (UM), ημιμεθυλιωμένο (HM) και μεθυλιωμένο (FM)). Στην συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν πειράματα κρυστάλλωσης των πρωτεϊνικών αυτών συμπλόκων και ακολούθησε ο προσδιορισμός των τρισδιάστατων δομών με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ. Η δομές προσδιορίστηκαν με την μέθοδο της μοριακής αντικατάστασης και βελτιστοποιήθηκαν μέχρι τη διακριτικότητα των 2.4 Å για το σύμπλοκο με το ήμιμεθυλιωμένο DNA και 2.6 Å για αυτό με το μεθυλιωμένοDNA. Η πρωτεΐνη εμφανίζεται χωρισμένη σε 2 επικράτειες, συνδεόμενες μέσω 1 βρόχου, σχηματίζοντας μια κοιλότητα, στο εσωτερικό της οποίας βρίσκεται το ολιγονουκλεοτίδιο DNA – στόχος.Η Ν-τερματική επικράτεια (κατάλοιπα 1-301) είναι μια μικτή α/β δομή αποτελούμενη από ένα συστραμμένο β-πτυχωτό φύλλο 10 κλώνων, που περιβάλλονται από α έλικες περίπου παράλληλα προς τους β-κλώνους. Αυτή η διαμόρφωση είναι γνωστή ως αναδίπλωση ΜΤασης και βρίσκεται συντηρημένη σε πολλές άλλες ΜΤασες. Η αναδίπλωση ΜΤασης ξεκινάει με την αΑ α έλικα και συνεχίζει με εναλλασσόμενους παράλληλους β-κλώνους και α-έλικες, με την εξαίρεση ενός αντιπαράλληλου β-κλώνου (β7) που ακολουθεί αμέσως μετά τον β6. Στην περίπτωση της M.BseCI, η Ν-τερματική της επικράτεια συγκροτείται από 2 επιπλέον α-έλικες και ένα επιπλέον β-πτυχωτό φύλλο 3 αντιπαράλληλων κλώνων, συνοδευόμενο από μία α-έλικα. Τα υπόλοιπα κατάλοιπα της M.BseCI συγκροτούν την C-τερματική επικράτεια της πρωτεΐνης (αα 302-579), και δεν διαθέτουν μια τόσο εκτενή δευτεροταγή δομή.Η δομική ανάλυση της M.BseCI επιβεβαιώνει ότι κάποια χαρακτηριστικά των γ-N6-DNA ΜΤασων αδενίνης είναι εμφανώς συντηρημένα σε όλα τα μέλη τους . Η M.BseCI όπως η M.TaqI στρέφουν την προς μεθυλίωση αδενίνη κατά 180ο εκτός της διπλής έλικας του DNA και εντός μιας κοιλότητας που σχηματίζει το ενεργό τους κέντρο, στην Ν-τερματική επικράτεια τους. Ενώ η Ν-τερματική επικράτεια εμφανίζει αμινοξική, δομική και λειτουργική συντήρηση, υπάρχουν μεγάλες διαφορές στην C-τερματική που είναι υπεύθυνη για μεγάλο μέρος της αναγνώρισης της αλληλουχίας-στόχου. Παρά τις αναμενόμενες αυτές διαφορές όμως καθώς διαφοροποιείται η αλληλουχία αναγνώρισης της κάθε πρωτεΐνης, εμφανίζεται μια γενικότερη δομική ομολογία και αντιστοιχίες καταλοίπων που εμπλέκονται στην αναγνώριση του DNA στόχου των ενζύμων στις δύο C-τερματικές επικράτειες, γεγονός που δεν διαφαίνεται σε επίπεδο πρωτοταγούς δομής, Ακόμα και αν υποτεθεί ότι οι αλληλουχίες που μεθυλιώνουν οι M.BseCI και M.TaqI είναι παρεμφερείς, καθώς εμπεριέχουν τον κοινό πυρήνα 5΄-TCGA-3, και δικαιολογούν τις ομοιότητες στην C-τερματική περιοχή τους, στην περίπτωση της ορφανής γ-N6-adenine DNA ΜΤασης CamA , με αλληλουχία αναγνώρισης 5’-CAAAAA-3’ κάτι τέτοιο δεν ισχύει και παρόλα αυτά, η συντήρηση δομικών στοιχείων και ειδικών αλληλεπιδράσεων είναι ακόμη μεγαλύτερη.Οι τρεις αυτές ΜΤασες, επίσης εμφανίζουν παρόμοια παραμόρφωση του σκελετού του DNA κατά την στρέψη της αδενίνης στόχου εκτός της διπλής έλικας. Η έντονη συμπίεση του σκελετού γύρω από την αδενίνη, η απουσία αμινοξέων στην κενή θέση που βρισκόταν και η απουσία αλλαγών στο ζευγάρωμα των υπολοίπων βάσεων, είναι φαινόμενα που προς στιγμήν παρατηρούνται μόνο στις γ-N6-adenine DNA ΜΤασες. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο πραγματοποιείται η στρέψη της αδενίνης δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως, όπως και ο μηχανισμός ώθησης της αδενίνης να επιστρέψει εντός της διπλής έλικας μετά το πέρας της μεθυλίωσης. Ένα επίσης σημαντικό χαρακτηριστικό της μεθυλίωσης του DNA αποτελεί η ικανότητα των DNA ΜΤασων να διακρίνουν την κατάσταση μεθυλίωσης των υποστρωμάτων του DNA που αναγνωρίζουν, μεταξύ αυτών που διαθέτουν μεθυλομάδες στον ένα κλώνο τους (ήμι-μεθυλιωμένο DNA) και αυτών που δεν έχουν υποστεί μεθυλίωση. Στη δομή και των δύο συμπλόκων της M.BseCI φαίνεται να πραγματοποιείται base flipping, ανεξάρτητα από την κατάσταση μεθυλίωσης της αδενίνης, κατ’ αντιστοιχία με προηγούμενες μελέτες στην C5 ΜΤαση κυτοσίνης M.HhaI με προσδεδεμένο ένα αβασικό νουκλεοτίδιο στην θέση στόχο, που έδειξαν ότι το ένζυμο στρέφει τον φωσφοσακχαρικό σκελετό εκτός της έλικας του DNA (O’Gara et al. 1998). Είναι πιθανόν συνεπώς, να μην προωθεί το base flipping η ίδια η προς μεθυλίωση βάση, αλλά ο σκελετός του DNA. (X Cheng and Roberts 2001). Μια ακόμη παράμετρος της μεθυλίωσης η οποία στους προκαρυωτικούς οργανισμούς δεν έχει αποκωδικοποιηθεί πλήρως, είναι η επιλογή του σωστού προσανατολισμού του DNA από την ΜΤαση σε συμμετρικές αλληλουχίες αναγνώρισης, έτσι ώστε να μεθυλιωθεί ο θυγατρικός κλώνος του νέο-συντιθέμενου DNA που παραμένει μη μεθυλιωμένος μετά την αντιγραφή. Στην περίπτωση της M.BseCI, φαίνεται να υπάρχει μια μικρή υδρόφοβη πλατφόρμα γύρω από την ήδη μεθυλιωμένη αδενίνη Α17 στον άλλο κλώνο του DNA, υποδηλώνοντας ότι η ήδη μεθυλιωμένη αδενίνη καθοδηγεί την πρόσδεση του ενζύμου με σωστό προσανατολισμό σε ήμι-μεθυλιωμένες αλληλουχίες DNA που φέρουν την αλληλουχία αναγνώρισης του. Αν και ένας τέτοιος μηχανισμός φαίνεται πιθανός και αποτελεσματικός, δεν φαίνεται να παρουσιάζεται στο σύμπλοκο με την M.TaqI, και χρειάζονται επιπλέον δομικές και βιοχημικές μελέτες προκειμένου να τεκμηριωθεί πλήρως.Συμπερασματικά, η δομική μελέτη της M.BseCI και απουσία DNA, και με ολιγονουκλεοτίδια που φέρουν την αλληλουχία αναγνώρισης του ενζύμου σε κάθε μορφή μεθυλίωσης, αποτελεί ένα σημαντικό βήμα για την περαιτέρω διασαφήνιση του μηχανισμού της Ν6-adenine μεθυλίωσης του DNA, μιας διεργασίας που καταλύεται από μια μεγάλη οικογένεια ενζύμων, με πολυδιάστατους ρόλους σε όλο το φάσμα των οργανισμών.