Study of the molecular mechanisms in piRNA-mediated gene regulation

Abstract

From prokaryotic CRISPR to eukaryotic RNA interference (RNAi), small RNA-based mechanisms have been universally employed to defend the host against genome invaders, including viruses and transposable elements. Transposons and endogenous retroviruses are genomic DNA sequences that can change their position within the genome (transposition), causing mutagenesis and threatening genome stability. In animal gonads, a germline-specific class of small RNAs, associate with the PIWI subfamily of Argonaute proteins (PIWI-interacting RNAs, piRNAs) and guide the suppression of transposable elements on both transcriptional and post-transcriptional level. From invertebrates to mammals, the piRNA pathway is essential for germ cell development and fertility. During piRNA biogenesis, large genomic loci (piRNA clusters) produce long single stranded RNA precursors which are processed into thousands of unique piRNA sequences in a non-predictable manner. As a result, millions of different piRNAs have been observed in flies and mice. This remarkable diversity combined with the tolerated mismatches during target-recognition, pose a challenge to understand the non-self specificity of the piRNA-mediated genome defense. Here we investigated mechanisms of piRNA-guided transcriptional silencing through a combination of molecular, genetic, and computational approaches. We particularly aimed to understand how the diverse population of piRNAs avoids off-target events that would permanently shut down essential host genes. To accomplish this goal, we developed a quantitative piRNA-sequencing method and a direct reporter assay to measure piRNA-guided silencing at single cell level. Our work revealed that universally the abundance of unique piRNA sequences is highly skewed and only a few of the most-abundant piRNAs are present in every cell. We observe that individual piRNA abundance is regulated during the biogenesis step and is determined by the sequence preferences of the Zucchini processor. Our direct reporter assay demonstrated that efficient silencing of a target correlates with the combined abundance of antisense piRNAs and allowed us to observe cell to cell differences in piRNA-mediated transcriptional silencing. The vast majority of the diverse piRNA sequences occur sporadically and establish cell to cell diversity. Biogenesis of these sporadic piRNAs could be indicative of a mechanism that allows adaptation to new invaders. Furthermore, by establishing cell to cell diversity, piRNAs could be promoting reproductive polymorphism and increase the chances of species survival under evolutionary pressure. A direct consequence of our study is that piRNA abundance becomes a key consideration when studying mechanisms of piRNA function, biogenesis and targeting.Our results also emphasized the importance of high-quality, quantitative piRNA datasets that accurately distinguish between rare and abundant piRNA sequences. Thus, during this PhD, we also established a simple and reliable method for the preparation of high-quality piRNA sequencing libraries. Our method has eliminated the need for radioactive labeling and UREA-polyacrylamide gel purification, and provided an unbiased view of the complete bona fide piRNA population in Drosophila. With our improved method, we characterized Piwi-piRNA complexes in the different cell lineages of the Drosophila ovary. We observe that the same PIWI protein targets different transposons in the germ cells and in the follicle cells of the ovary. Upon association with a piRNA, this PIWI protein enters the nucleus and is responsible for the de novo epigenetic silencing of active transposons. Follicle PIWI-piRNA complexes target almost exclusively a single family of retrotransposons, namely Gypsy, while the corresponding germ cell complexes target a broader range of retrotransposon families and different members of the Gypsy family. This observation is linked to the differential expression of piRNA-generating clusters in the two ovarian cell types. How this differential expression of piRNA-generating regions is initially established and how are the transposons that are neglected by the piRNA pathway in the different compartments controlled, are open questions that would require further investigation. In summary my PhD work provides novel insight into key questions regarding the piRNA-mediated transcriptional silencing and it created resources and foundations for future piRNA studies.

Από το CRISPR στους προκαρυώτες μέχρι και την παρεμβολή RNA (RNA interference, RNAi) στους ευκαρυώτες, μηχανισμοί που βασίζονται σε μικρά μόρια RNA, χρησιμοποιούνται εκτεταμένα για την άμυνα του ξενιστή ενάντια σε γονιδιωματικούς εισβολείς, όπως οι ιοί και τα μεταθετά στοιχεία (τρανσποζόνια). Τα τρανσποζόνια και οι ενδογενείς ρετροϊοί είναι αλληλουχίες γονιδιωματικού DNA, που έχουν τη δυνατότητα να μεταπηδούν σε διαφορετικές θέσεις μέσα στο γονιδίωμα (μετάθεση), προάγοντας έτσι τη μεταλλαξιγένεση και διακινδυνεύοντας τη σταθερότητα του γονιδιώματος. Στις γονάδες των ζώων, μία ειδική κατηγορία μικρών μορίων RNA, αλληλεπιδρούν με την PIWI υποοικογένεια των Αργοναυτών πρωτεϊνών (PIWI-interacting RNAs, piRNAs) και καθοδηγούν την καταστολή των μεταθετών στοιχείων σε μεταγραφικό και μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Από τα ασπόνδυλα στα θηλαστικά, το μονοπάτι piRNA είναι απαραίτητο για την ανάπτυξη των γαμετικών κυττάρων και τη γονιμότητα. Κατά τη βιογένεση των piRNA μορίων, μεγάλοι γονιδιακοί τόποι (piRNA clusters) παράγουν μακριά μονόκλωνα πρόδρομα RNA, τα οποία διασπώνται σε χιλιάδες ξεχωριστές αλληλουχίες piRNA με μη προβλέψιμο τρόπο. Ως αποτέλεσμα, εκατομμύρια μοναδικά piRNA έχουν ανιχνευθεί στη φρουτόμυγα και στο ποντίκι. H αξιοσημείωτη αυτή ποικιλία σε συνδυασμό με την ανοχή για μη πλήρη συμπληρωματικότητα κατά την αναγνώριση του στόχου, δυσκολεύουν την κατανόηση μας γύρω από την εξειδίκευση της piRNA-διαμεσολαβούμενης γονιδιωματικής άμυνας για ξένα στοιχεία. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν οι μηχανισμοί της piRNA-διαμεσολαβούμενης μεταγραφικής αποσιώπησης χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό μοριακών, γενετικών και υπολογιστικών προσεγγίσεων. Σκοπός της μελέτης ήταν να κατανοήσουμε πώς ο ιδιαίτερα ετερόκλιτος πληθυσμός των piRNA αποφεύγει άστοχα συμβάντα που θα οδηγούσαν στη μόνιμη αποσιώπηση σημαντικών για τον ξενιστή γονιδίων. Για την επίτευξη του στόχου αυτού, αναπτύχθηκαν μία ποσοτική μέθοδος αλληλούχισης piRNA και ένα σύστημα άμεσης αναφοράς (direct reporter assay) για τη μέτρηση της piRNA-διαμεσολαβούμενης μεταγραφικής αποσιώπησης σε κυτταρικό επίπεδο. Η μελέτη ανέδειξε πως η ποσότητα των μεμονωμένων αλληλουχιών piRNA είναι εξαιρετικά δυσανάλογη και πως μόνο τα κορυφαία σε αφθονία piRNA είναι παρόντα σε κάθε κύτταρο. Παρατηρήθηκε ότι η αφθονία των μεμονωμένων piRNA ρυθμίζεται στο στάδιο της βιογένεσης και καθορίζεται από τις προτιμήσεις του ενζύμου Zucchini. Το σύστημα άμεσης αναφοράς υπέδειξε πως η αποτελεσματική αποσιώπηση ενός στόχου σχετίζεται με τον συνδυαστικό αριθμό συμπληρωματικών μορίων piRNA και επέτρεψε την ανίχνευση διαφορών στην piRNA-διαμεσολαβούμενη μεταγραφική αποσιώπηση από κύτταρο σε κύτταρο. Η πλειοψηφία των ετερόκλητων piRNA αλληλουχιών προκύπτει σποραδικά και οδηγεί σε κυτταρική ανομοιογένεια. Η βιογένεση αυτών των σπάνιων piRNA ενδεχομένως να υποδεικνύει την ύπαρξη ενός μηχανισμού που επιτρέπει την προσαρμογή σε νέους εισβολείς. Επιπλέον, προωθώντας την κυτταρική ανομοιογένεια, τα piRNAs θα μπορούσαν να προάγουν την αναπαραγωγική ποικιλομορφία και να αυξάνουν τις πιθανότητες επιβίωσης του είδους υπό εξελικτικές πιέσεις. Μία άμεση συνέπεια της παρούσας εργασίας είναι ότι η αφθονία των μεμονωμένων μορίων piRNA πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κατά τη μελέτη μηχανισμών που αφορούν τη λειτουργία, βιογένεση και στόχευση των piRNA. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης υπέδειξαν επίσης την αναγκαιότητα για υψηλής ποιότητας, ποσοτικά δεδομένα αλληλούχισης piRNA. Συνεπώς, στα πλαίσια αυτής της διατριβής αναπτύχθηκε επίσης μία απλοποιημένη και αξιόπιστη μέθοδος για την προετοιμασία υψηλής ποιότητας βιβλιοθηκών piRNA για αλληλούχιση νέας γενιάς. Η καινούρια αυτή μέθοδος εξάλειψε την απαίτηση για ραδιοσήμανση και απομόνωση του RNA υπό αποδιατακτικές συνθήκες εξασφαλίζοντας έτσι την αμερόληπτη πρόσβαση στον πλήρη πληθυσμό piRNA της Drosophila melanogaster. Η βελτιωμένη αυτή μέθοδος, επέτρεψε το χαρακτηρισμό των συμπλόκων Piwi-piRNA στις διαφορετικές κυτταρικές σειρές της ωοθήκης στην Drosophila έπειτα από διασταυρώσεις. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν πως η ίδια PIWI πρωτεΐνη ρυθμίζει ξεχωριστά μεταθετά στοιχεία στα κύτταρα της γαμετικής σειράς και στα ωοθυλακικά κύτταρα της ωοθήκης. Έπειτα από πρόσδεση ενός piRNA, η συγκεκριμένη PIWI πρωτεΐνη εισέρχεται στον πυρήνα όπου μεσολαβεί στην de novo επιγενετική αποσιώπηση των ενεργών μεταθετών στοιχείων. Στα ωοθυλακικά κύτταρα τα σύμπλοκα PIWI-piRNA στοχεύουν σχεδόν αποκλειστικά μία οικογένεια μεταθετών στοιχείων που ονομάζεται Gypsy. Αντιθέτως, τα αντίστοιχα σύμπλοκα στα κύτταρα της γαμετικής σειράς στοχεύουν ένα εύρος οικογενειών μεταθετών στοιχείων και ξεχωριστά μέλη της οικογένειας Gypsy. Τα αποτελέσματα αυτά συνδέονται με την διαφορική έκφραση των piRNA clusters που παρατηρήθηκε στους δύο κυτταρικούς τύπους της ωοθήκης. Πώς αυτή η διαφορική έκφραση των γονιδιακών τόπων που παράγουν piRNAs καθιερώνεται αρχικά και πώς ελέγχονται τα μεταθετά στοιχεία που παραβλέπονται από το μονοπάτι piRNA στις διαφορετικές κυτταρικές σειρές της ωοθήκης, είναι ερωτήματα που απαιτούν περαιτέρω μελέτη. Εν κατακλείδι, η παρούσα διδακτορική εργασία συμβάλει στην κατανόηση της piRNA-διαμεσολαβούμενης μεταγραφικής αποσιώπησης και παράλληλα δημιούργησε θεμέλια και μεθόδους για μελλοντικές piRNA μελέτες.