Mechanisms of subcellular traffic, function and molecular evolution of transporters

Abstract

Plasma membrane (PM) proteins mediating cell nutrition, communication and adaptation to physiological or stress signals are essential to all organisms. In eukaryotic cells, the first step in their biogenesis is their co-translational translocation from ribosomes to the membrane of the endoplasmic reticulum (ER). According to the current belief, PM proteins exit the ER in COPII vesicles that fuse to the cis-Golgi and then reach the trans-Golgi network via Golgi maturation, before being dispatched to the PM. Fusion between vesicular intermediates and target membranes is mediated by soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors (SNAREs), tethering proteins, small GTPases and other regulatory factors. This trafficking route, often referred to as conventional protein secretion, is considered to be the major pathway for translocation of most membrane proteins to the PM. However, emerging evidence from different groups has challenged aspects of the conventional trafficking route of membrane cargoes. More specifically, in several cases, specific cargoes have been shown to follow unconventional protein secretion (UPS), bypassing vesicular secretion or sorting via the Golgi apparatus, on their way to the PM. Surprisingly, there are only a few studies following the biogenesis of the most abundant PM proteins, such as transporters, receptors or channels.Filamentous fungi, such as Aspergillus nidulans, Neurospora crassa or Ustilago maydis, have emerged as powerful model organisms for performing in vivo cell biology studies. Due to their polar mode of growth, and similar to most polar cells in animals and plants, filamentous fungi need to regulate the targeting and distribution of membrane proteins to specific apical or basolateral areas of the PM. For example, as our lab has showed, nutrient transporters of A. nidulans are distributed homogeneously all along the PM, whereas membrane proteins involved in apical growth are polarly positioned and maintained at the growing tip of hyphae cells. Furthermore, we have shown, along with other fungal groups, that the polarly localized apical membrane proteins of A. nidulans follow the conventional, Golgi-dependent, secretory route to be sorted to the apex of growing hyphae, similar to findings in yeast and polar mammalian cells. In contrast, no studies, in filamentous fungi, yeast or any other system, have examined how nutrient transporters or other non-polarly positioned cargoes translocate to the PM.In the first part of the present thesis, we developed a novel genetic system to study the anterograde trafficking of nutrient transporters in A. nidulans. Using as our principal non-polar membrane cargo the well-studied uric-acid/xanthine transporter UapA, but also other transporters, we obtained experimental evidence that the trafficking of neosynthesized transporters, after COPII-dependent exit from the ER, occurs via ‘Golgi-bypass’. These surprising findings strongly suggest the existence of distinct, cargo-specific, ER-exit mechanisms and/or alternative COPII subpopulations. In the second part of the thesis, we extended our experimental approach to essential PM proteins, such as the proton pump PmaA and the pH signaling component PalI, which differ significantly from nutrient transporters in several aspects in terms of structure and physiologic function, but also show a non-polar distribution at the PM. We showed that these cargoes, similar to transporters, also bypass the Golgi during their biosynthesis, which in turn suggests that all non-polar cargoes might be translocated to the PM via a Golgi-independent mechanism.In the third part of this thesis, we searched for proteins that might be critical for the discrimination between Golgi-independent and Golgi-dependent trafficking routes. As a first approach, we performed a series of genetic screens, using as a model Golgi-bypasser the UapA transporter, whose mislocalization from the PM could be easily monitored by growth tests on media containing its physiological substrate, uric acid, as sole nitrogen source or toxic analogues. Through these genetic screens, we selected mostly transcriptional or translational mutations leading to the non-expression of UapA. Unfortunately, we did not obtain any mutation affecting the trafficking of UapA to the PM. These results point to the idea that factors involved in Golgi-bypass might be essential for cell survival, so that, future genetic screens should be re-designed in order to select conditional or hypomorphic trafficking mutations. As an alternative unbiased approach to identify proteins involved in Golgi-bypass of transporters or other membrane proteins, we employed a proximity-dependent biotinylation method (PDB) coupled to proteomic analysis. This is expected in principle, to identify proteins that might interact transiently with UapA in the course of ER-exit and eventual translocation to the PM. Optimization of this assay during the present thesis lays the foundation for the identification of transient UapA interactors in the very near future. As a third approach, we also performed a systematic analysis of several proteins already known to be implicated in the conventional trafficking process. This analysis revealed that Sec12 and Ykt6, which participate in COPII biogenesis and membrane fusion, respectively, are indeed critical in the discrimination between the Golgi-dependent and Golgi-independent mechanism of membrane trafficking.In the fourth part of the thesis, we employed Photoactivated Localization Microscopy (PALM), a super-resolution microscopy technique, to perform a finer analysis of the dynamics of UapA-containing carriers during trafficking. We thus confirmed the dispensability of key Golgi-effectors (SedV, RabE) and the essentiality of the Qa-SNARE SsoA for the trafficking of this model Golgi-bypasser. In addition, we showed the super-fast (< 1 s) and short-distance (<1 μΜ) movement of cargoes that use Golgi-bypass to be sorted to the PM, in contrast to the long-distance and easily-tracked transport of conventionally secreted cargoes across the microtubule tracks.In summary, through this work, we discovered a novel, Golgi-independent, trafficking pathway driving the biogenesis of non-polarly positioned transmembrane proteins in A. nidulans, and we gained insight into some of the characteristics of this newly-identified trafficking route. Notably, our findings point to the idea that Golgi-bypass might not constitute a fungal-specific peculiarity, but rather be a novel major and cargo-specific sorting route in eukaryotic cells that has been largely ignored.

Οι πρωτεΐνες της πλασματικής μεμβράνης είναι απαραίτητες σε όλους τους οργανισμούς, καθώς μεσολαβούν στην πρόσληψη θρεπτικών, την επικοινωνία των κυττάρων αλλά και την απόκριση σε φυσιολογικά ερεθίσματα ή στρεσογόνους παράγοντες. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, το πρώτο βήμα στη βιογένεσή τους είναι η συμμεταφραστική τους μετατόπιση από τα ριβοσώματα στη μεμβράνη του ενδοπλασματικού δικτύου (ΕΔ). Σύμφωνα με την τρέχουσα γνώση, οι πρωτεΐνες της πλασματικής μεμβράνης εξέρχονται από το ΕΔ μέσα σε κυστίδια COPII, τα οποία συντήκονται στο cis-Golgi και έπειτα φτάνουν μέσω ωρίμανσης του συμπλέγματος Golgi στο trans-Golgi, από όπου αποστέλλονται στην πλασματική μεμβράνη. Η διαμεσολαβούμενη σύντηξη κυστιδιακών δομών και μεμβρανών-στόχων πραγματοποιείται από πρωτεΐνες SNAREs, πρωτεΐνες πρόσδεσης, μικρές GTPases και άλλους ρυθμιστικούς παράγοντες. Αυτή η οδός διακίνησης, που συχνά αναφέρεται ως συμβατική οδός έκκρισης πρωτεϊνών, θεωρείται ως το κύριο μονοπάτι για την υποκυτταρική διακίνηση των περισσότερων πρωτεϊνών της πλασματικής μεμβράνης. Ωστόσο, νέα δεδομένα από διαφορετικές ερευνητικές ομάδες έχουν αρχίσει να αμφισβητούν πτυχές της συμβατικής οδού διακίνησης των μεμβρανικών πρωτεϊνών. Συγκεκριμένα, σε αρκετές περιπτώσεις, έχει δειχθεί ότι κάποιες πρωτεΐνες ακολουθούν μια μη-συμβατική οδό, παρακάμπτοντας την έκκριση μέσω κυστιδίων ή τη διακίνησή μέσω του συμπλέγματος Golgi, στην πορεία τους προς την πλασματική μεμβράνη. Παραδόξως, ελάχιστες έρευνες έχουν μελετήσει τον μηχανισμό βιογένεσης των πιο άφθονων πρωτεϊνών της πλασματικής μεμβράνης, όπως των μεταφορέων, των υποδοχέων ή των καναλιών.Οι νηματοειδείς μύκητες, όπως οι Aspergillus nidulans, Neurospora crassa ή Ustilago maydis, έχουν αναδειχθεί ως πρότυποι οργανισμοί για την in vivo διεξαγωγή πειραμάτων κυτταρικής βιολογίας. Λόγω του πολικού τρόπου ανάπτυξής τους, όπως συμβαίνει και στα περισσότερα πολικά κύτταρα ζώων και φυτών, οι νηματοειδείς μύκητες πρέπει να ρυθμίσουν τη στόχευση και την κατανομή των πρωτεϊνών σε συγκεκριμένες περιοχές της κορυφαίας ή της πλαγιοβασικής μεμβράνης. Για παράδειγμα, όπως έχουμε δείξει στο εργαστήριό μας, οι μεταφορείς θρεπτικών ουσιών στον A. nidulans είναι ομοιογενώς κατανεμημένοι καθ’ όλο το μήκος της πλασματικής μεμβράνης, ενώ οι μεμβρανικές πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην αύξηση τοποθετούνται πολικά και διατηρούνται στην αναπτυσσόμενη άκρη των υφών. Επιπλέον, έχουμε δείξει, όπως και άλλες ομάδες που μελετούν νηματοειδείς μύκητες, ότι οι πρωτεΐνες που τοποθετούνται πολικά στην ακραία περιοχή της πλασματικής μεμβράνης του A. nidulans ακολουθούν τη συμβατική, εξαρτώμενη από το σύμπλεγμα Golgi, εκκριτική οδό, όπως άλλωστε συμβαίνει και σε ζύμες και πολικά κύτταρα θηλαστικών. Αντιθέτως, καμία μελέτη σε νηματοειδείς μύκητες, ζύμες ή κάποιο άλλο σύστημα, δεν έχει εξετάσει πώς διακινούνται στην πλασματική μεμβράνη οι μεταφορείς θρεπτικών ουσιών ή άλλες μεμβρανικές πρωτεΐνες που δεν εμφανίζουν πολική κατανομή.Στο πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής, αναπτύξαμε ένα νέο γενετικό σύστημα για τη μελέτη της διακίνησης διαμεμβρανικών μεταφορέων θρεπτικών ουσιών στον A. nidulans. Χρησιμοποιώντας ως πρότυπο μη-πολικής μεμβρανικής πρωτεΐνης τον εξαιρετικά μελετημένο μεταφορέα ουρικού οξέος/ξανθίνης UapA, αλλά στη συνέχεια και άλλους μεταφορείς, συλλέξαμε πειραματικά στοιχεία που δείχνουν ότι η διακίνηση νεοσυντιθέμενων μεταφορέων, μετά την έξοδο από το ΕΔ σε κυστίδια COPII, πραγματοποιείται μέσω ενός μηχανισμού που παρακάμπτει το σύμπλεγμα Golgi. Αυτά τα απροσδόκητα αποτελέσματα υποστηρίζουν σθεναρά την ύπαρξη διακριτών μηχανισμών εξόδου από το ΕΔ, ειδικών για την εκάστοτε πρωτεΐνη ή/και εναλλακτικών πληθυσμών κυστιδίων COPII. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, επεκτείναμε την πειραματική μας προσέγγιση σε ζωτικής σημασίας πρωτεΐνες της πλασματικής μεμβράνης, όπως η αντλία πρωτονίων PmaA και η σχετιζόμενη με τη ρύθμιση του pH πρωτεΐνη PalI, οι οποίες διαφέρουν από τους μεταφορείς θρεπτικών ουσιών σε πολλούς τομείς, σχετικούς με τη δομή και τη φυσιολογική λειτουργία τους, διατηρώντας όμως και αυτές μια μη πολική κατανομή στην πλασματική μεμβράνη. Δείξαμε ότι οι πρωτεΐνες αυτές, όπως και οι μεταφορείς, παρακάμπτουν το σύμπλεγμα Golgi κατά τη βιοσύνθεσή τους, γεγονός που υποδηλώνει ότι όλες οι πρωτεΐνες που είναι μη-πολικά κατανεμημένες στην πλασματική μεμβράνη διακινούνται μέσω ενός μη-συμβατικού μηχανισμού ανεξάρτητου του Golgi.Στο τρίτο μέρος της διδακτορικής διατριβής, αναζητήσαμε πρωτεΐνες που μπορεί να είναι σημαντικές για τη διάκριση μεταξύ της ανεξάρτητης και της εξαρτώμενης από το Golgi οδού διακίνησης πρωτεϊνών. Ως πρώτη προσέγγιση, πραγματοποιήσαμε μια σειρά γενετικών πειραμάτων διαλογής μεταλλαγών χρησιμοποιώντας ως πρότυπη μη-συμβατικά εκκρινόμενη πρωτεΐνη τον μεταφορέα UapA του οποίου περιπτώσεις ελλαττωματικής στόχευσης στη μεμβράνη είναι δυνατόν να αναγνωριστούν μέσω μη-φυσιολογικής ανάπτυξης σε θρεπτικό μέσο που εμπεριέχει υποστρώματα (π.χ. ουρικό οξύ) η τοξικά ανάλογα υποστρωμάτων του μεταφορέα. Ωστόσο, μέσω αυτών των γενετικών πειραμάτων, απομονώσαμε κυρίως μεταγραφικές ή μεταφραστικές μεταλλαγές που οδηγούν στη μη-έκφραση του UapA. Δυστυχώς, δεν πήραμε καμία μεταλλαγή που να επηρεάζει τη διακίνηση του UapA στην πλασματική μεμβράνη. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι οι παράγοντες που εμπλέκονται στο μονοπάτι που παρακάμπτει το σύμπλεγμα Golgi φαίνεται να είναι απαραίτητοι για την επιβίωση του κυττάρου, και έτσι μελλοντικά αντίστοιχα πειράματα θα πρέπει να επανασχεδιαστούν με σκοπό την επιλογή μεταλλαγών που οδηγούν σε υπομορφικούς φαινοτύπους (conditional ή hypomorphic). Σαν εναλλακτική προσέγγιση για τον εντοπισμό πρωτεϊνών που μπορεί να εμπλέκονται στο μονοπάτι που παρακάμπτει το σύμπλεγμα Golgi, χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο Proximity Dependent Biotinylation (PDB) σε συνδυασμό με πρωτεομική ανάλυση. Κατά βάση αναμέναμε να εντοπίσουμε πρωτεΐνες που αλληλοεπιδρούν παροδικά με τον UapΑ κατά τη διάρκεια της διαδρομής του από το ΕΔ στην πλασματική μεμβράνη. Η βελτιστοποίηση αυτής της τεχνικής κατά τη διάρκεια της παρούσας διατριβής έχει ήδη θέσει τα θεμέλια για να τον εντοπισμό των προαναφερθέντων πρωτεϊνών. Ως τρίτη προσέγγιση, πραγματοποιήσαμε μια συστηματική ανάλυση πρωτεϊνών που είναι ήδη γνωστό ότι εμπλέκονται στη συμβατική διαδικασία πρωτεϊνικής διακίνησης. Η ανάλυση αυτή αποκάλυψε ότι οι πρωτεΐνες Sec12 και Ykt6, που συμμετέχουν στη βιογένεση των COPII κυστιδίων και στη σύντηξη μεμβρανών, αντίστοιχα, είναι πράγματι σημαντικές για τη διάκριση μεταξύ του μονοπατιού που εξαρτάται από το σύμπλεγμα Golgi και αυτού που το παρακάμπτει.Στο τέταρτο μέρος της διατριβής, χρησιμοποιήσαμε τεχνική μικροσκοπίας υψηλής ευκρίνειας, συγκεκριμένα την Photoactivated Localization Microscopy (PALM), με σκοπό την λεπτομερή ανάλυση των μεμβρανικών δομών που διακινούν τον μεταφορέα UapA. Μέσω αυτής επιβεβαιώσαμε ότι οι βασικοί τελεστές του συμπλέγματος Golgi (SedV, RabE) είναι περιττοί ενώ η Qa-SNARE SsoA είναι απολύτως αναγκαία για την τελική μετατόπιση του UapA στην πλασματική μεμβράνη. Επιπλέον, δείξαμε ότι οι μεμβρανικές δομές που εμπεριέχουν τον UapA παρακάμπτουν το σύμπλεγμα Golgi επιτελούν μια ταχύτατη (< 1 s) και σύντομη (< 1 μΜ) μετακίνηση προς την πλασματική μεμβράνη, σε αντίθεση με τους φορείς που εκκρίνονται μέσω του συμβατικού μονοπατιού, οι οποίοι διανύουν σημαντικές αποστάσεις κατά τη μεταφορά τους πάνω σε μικροσωληνίσκους, και κατ’ επέκταση εύκολα ανιχνεύσιμες.Συνοψίζοντας, μέσα από αυτήν την εργασία, ανακαλύψαμε ένα νέο μονοπάτι για τη διακίνηση διαμεμβρανικών μη-πολικά κατανεμημένων πρωτεϊνών στον A. nidulans το οποίο είναι ανεξάρτητο από το σύμπλεγμα Golgi και αποκτήσαμε μια εικόνα για ορισμένα από τα χαρακτηριστικά του. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι η παρακαμπτήρια από το σύμπλεγμα Golgi οδός φαίνεται να μην αποτελεί απλά μια ιδιαιτερότητα των μυκήτων, αλλά πιθανόν μία νέα βασική και οδό διακίνησης, εξειδικευμένη για την εκάστοτε πρωτεΐνη, στα ευκαρυωτικά κύτταρα, που μέχρι τώρα έχει αγνοηθεί.