Μετα-μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων που εμπλέκονται στις νευροεκφυλιστικές νόσους: ο ρόλος της ΤΙΑ1 στην έκφραση της α-συνουκλεΐνης

Abstract

Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder, with unclear etiopathology, multifactorial profile, and substantial societal costs worldwide. There is currently no disease-modifying treatment. A-synuclein (SNCA) is an abundant neuronal protein normally localized in the presynaptic limbs and involved in the pathogenesis of PD, making it a top therapeutic target of interest. The significantly more frequent idiopathic forms of the disease suggest that an environmental stimulus, coupled with aging, is required for SNCA to oligomerize and localize to large protein inclusions, known as Lewy bodies, that will impact PD development. Among the causative proteins implicated in familial cases of neurodegeneration, those that orchestrate mass responses to environmental stress are likely to be at the core of neuropathogenetic mechanisms. These are the RNA-binding proteins (RBPs) that include, among others, T-cell intracellular antigen 1 (TIA1). TIA1 is a widely expressed DNA/RNA binding protein that regulates multiple aspects of RNA metabolism. It includes domains that confer prion protein properties and is an essential protein responsible for stress granule formation in response to environmental stress. Its overexpression leads to misfolding of TAU in Alzheimer's disease, while its mutations lead to amyotrophic lateral sclerosis development. Based on the above, this Ph.D. thesis aimed to investigate whether TIA1 is involved or is capable of triggering PD pathogenesis. To answer the above questions, differentiated human neuroblastoma cell lines (SK-N-SH or SH-SY5Y) were used as a model system, while plasmid and viral vectors were used to modulate SNCA and TIA1 levels. Initially, the binding of TIA1 to SNCA mRNA was examined. After incubating different SNCA biotinylated probes with cell extracts, it was revealed that TIA1 selectively binds to the initial segment of the 3'-untranslated region (UTR) of SNCA and not to the 5'UTR or coding region. However, neither overexpression nor silencing of TIA1 altered endogenous SNCA mRNA or protein levels. Further, the co-immunoprecipitation analysis revealed no direct interaction between TIA1 and SNCA. In contrast, simultaneous overexpression of the two proteins resulted in a substantial increase in the aggregation and serine 129 phosphorylation of SNCA in both the soluble and insoluble fractions of the protein extracts. Proteasomes and autophagy pathway are essential in removing intracellular SNCA monomers and inclusions, respectively, while multiple kinases and phosphatases control SNCA phosphorylation. Further, SNCA levels are altered under the influence of mitochondrial oxidizing agents in both in vivo and in vitro conditions (e.g. neurotoxin MPP+, rotenone, 6-OHDA), and mitochondrial dysfunction drives SNCA accumulation, and mutations in genes related to mitochondrial metabolism lead to familial PD. Consequently, the role of TIA1 in these pathways was examined. TIA1 overexpression reduced total PP2A phosphatase activity in SH-SY5Y cells, but this effect was not due to the change in the levels of PP2A subunits or its intracellular regulators. Based on the preceding results and the fact that TIA1 is a sticky/prion protein, its interaction with the cell proteome was investigated next. Ascorbic acid peroxidase (APEX2) fused to TIA1 was used to label its interaction network in vivo, allowing subsequent ex vivo analysis. Using this method, all TIA1 partners at a distance of 20 nm under both normal and acute stress conditions were labeled. Then, using mass spectrometry for identification and co-immunoprecipitation for validation, the proteins directly associated with TIA1 were identified. Most proteins were associated with ribonucleoprotein complexes in both control and stress conditions. However, the repertoire of TIA1-protein partners was remarkably dissimilar between the two cellular conditions. Under physiological conditions, the TIA1-interacting proteome was enriched in cell-soluble processes associated with mRNA metabolism. Under stress conditions, TIA1-labeled partners displayed a broader subcellular distribution, including chromosomes and mitochondria. Taken together, these data highlight the spatial environment of TIA1 with its different partners in diverse cellular situations and pave the way for elucidating the role of TIA1 in these processes. In conclusion, robust data are presented on the effect of TIA1 on mechanisms linked to SNCA aggregation and phosphorylation as well as the proteome with which TIA1 interacts, facilitating the future investigation of the molecular mechanisms by which TIA1 exerts its effects.

H νόσος του Πάρκινσον (ΝΠ) είναι η δεύτερη πιο συχνή νευροεκφυλιστική διαταραχή, με ασαφή παθοφυσιολογία, πολυπαραγοντικό προφίλ και τεράστιο κοινωνικό κόστος παγκοσμίως. Παρόλα αυτά, προς το παρόν δεν υπάρχει τροποποιητική της νόσου θεραπεία. Η α-συνουκλεΐνη είναι μία άφθονη νευρωνική πρωτεΐνη, η οποία εντοπίζεται στα προσυναπτικά άκρα και εμπλέκεται στην παθογένεια της ΝΠ, γεγονός που την καθιστά κορυφαίου θεραπευτικού ενδιαφέροντος στόχο. Οι σημαντικά συχνότερες ιδιοπαθείς μορφές της νόσου υποδηλώνουν ότι απαιτείται ένα περιβαλλοντικό ερέθισμα, σε συνδυασμό με τη γήρανση, για να εντοπιστεί τελικά η α-συνουκλεΐνη στα πρωτεϊνικά έγκλειστα που σχετίζονται με τη νόσο. Μεταξύ των αιτιολογικών πρωτεϊνών που έχουν ενοχοποιηθεί μέχρι στιγμής από τις οικογενείς περιπτώσεις νευροεκφυλισμού, εκείνες που ενορχηστρώνουν τις αποκρίσεις στο περιβαλλοντικό στρες πιθανότατα βρίσκονται στον πυρήνα των νευροπαθογενετικών μηχανισμών. Πρόκειται για τις πρωτεΐνες που δεσμεύουν RNA (RBPs) και περιλαμβάνουν μεταξύ άλλων το ενδοκυτταρικό αντιγόνο 1 των Τ-κυττάρων (TIA1). Η TIA1 είναι μια ευρέως εκφραζόμενη πρωτεΐνη δέσμευσης DNA/RNA που ρυθμίζει πολλαπλές πτυχές του μεταβολισμού των RNA. Περιλαμβάνει περιοχές που της προσδίδουν ιδιότητες ιοειδών πρωτεϊνών ενώ είναι μία από τις βασικές πρωτεΐνες των κοκκίων στρες που σχηματίζονται ως απόκριση σε περιβαλλοντικό στρες. Έχει δειχθεί ότι η υπερέκφρασή της οδηγεί σε λανθασμένη αναδίπλωση της TAU στη νόσο Αλτσχάιμερ ενώ μεταλλαγές της οδηγούν σε αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση. Με βάση τα παραπάνω, στην παρούσα διδακτορική διατριβή, εξετάσαμε κατά πόσον η TIA1 θα μπορούσε να εμπλέκεται στην παθογένεια της ΝΠ. Προκειμένου να απαντηθούν τα παραπάνω ερωτήματα, χρησιμοποιήθηκαν, ως σύστημα-μοντέλο, διαφοροποιημένες κυτταρικές σειρές νευροβλαστώματος ανθρώπου (SK-N-SH και SH-SY5Y), και πλασμιδιακοί όσο και ιικοί φορείς για την διαφορική έκφραση των α-συνουκλεΐνη και TIA1. Στην παρούσα εργασία, αρχικά, έπειτα από κατακρήμνιση βιοτινυλιωμένων τμημάτων του RNA της α-συνουκλεΐνης, αποκαλύφθηκε, ότι η ΤΙΑ1 συνδέεται εκλεκτικά στα πρώτα 560 νουκλεοτίδια της 3’-αμετάφραστης περιοχής του RNA αυτής και όχι στις υπόλοιπες κύριες περιοχές αυτού (5’UTR και κωδική περιοχή) υποδεικνύοντας πιθανή ρυθμιστική αλληλεπίδραση. Εντούτοις, ούτε η υπερέκφραση ούτε η αποσιώπηση της TIA1 μεταβάλλουν τα ενδογενή πρωτεϊνικά επίπεδα της α-συνουκλεΐνης. Επιπλέον, η δοκιμασία συν-ανοσοκατακρήμνισης δεν αποκάλυψε άμεση αλληλοεπίδραση των δύο πρωτεϊνών. Αντίθετα, έπειτα από ταυτόχρονη υπερέκφραση των δύο πρωτεϊνών για την επαγωγή συσσωματωμάτων της α-συνουκλεΐνης διαπιστώθηκε δραματική αύξηση της συσσωμάτωσης της τόσο στο διαλυτό όσο και στο μη διαλυτό κλάσμα του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος καθώς και της φωσφορυλίωσής της στη σερίνη 129. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία, το πρωτεάσωμα και το λυσόσωμα έχουν σημαντικό ρόλο στην απομάκρυνση των ενδοκυτταρικών ειδών α-συνουκλεΐνης ενώ συγκεκριμένες κινάσες/φωσφατάσες ελέγχουν την φωσφορυλίωσή της. Επίσης, είναι γνωστό πως τα επίπεδα της α-συνουκλεΐνης μεταβάλλονται υπό την επίδραση παραγόντων που προκαλούν στρες τόσο σε in vivo όσο και σε in vitro συνθήκες (π.χ νευροτοξίνη MPP, ροτενόνη, 6-OHDA. και η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία επάγει τη συσσωμάτωση της α-συνουκλεΐνης, ενώ μεταλλαγές σε γονίδια που σχετίζονται με το μεταβολισμό των μιτοχονδρίων οδηγούν σε οικογενή ΝΠ. Με βάση τα παραπάνω, διερευνήθηκε ο ρόλος της TIA1 στα παραπάνω μονοπάτια. Παρότι η συνολική ενεργότητα φωσφατασών στα κύτταρα SH-SY5Y μειώθηκε έπειτα από υπερέκφραση της TIA1, ούτε τα πρωτεϊνικά επίπεδα της PP2A αλλά ούτε και των ενδοκυτταρικών ρυθμιστών αυτής, μεταβλήθηκαν. Επιπλέον, η TIA1 ανέστειλε τη δραστηριότητα του πρωτεασώματος οδηγώντας στη συσσώρευση των ουβικουιτινιλιωμένων πρωτεϊνών. Ως αποτέλεσμα της δυσλειτουργίας του πρωτεασώματος, παρατηρήθηκε αύξηση των πρωτεϊνικών επιπέδων της ρυθμιστικής υπομονάδας RPT6 και της καταλυτικής της υπομονάδας 5 (PSMB5), καθώς και αύξηση των ενδογενών επιπέδων του μεταγραφικού παράγοντα NRF1, ο οποίος ελέγχει την έκφραση των γονιδίων του πρωτεασώματος. Όσον αφορά την αυτοφαγία, η TIA1 ανέστειλε την αυτοφαγική ροή, μεταβάλλοντας τα πρωτεϊνικά επίπεδα βασικών μορίων που σχετίζονται με την αυτοφαγία, συμπεριλαμβανομένων των p62, BECLIN1, AMBRA1 και του συμπλόκου ATG5-ATG12. Στη συνέχεια, για να εκτιμηθεί η επίδραση της TIA1 στη μιτοχονδριακή λειτουργία, μετρήθηκαν τα επίπεδα ATP και δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS). Υπήρξε σημαντική μείωση του λόγου ATP προς ADP και διπλάσια αύξηση των ROS, γεγονός που υποδηλώνει ότι η TIA1 βλάπτει τη μιτοχονδριακή λειτουργία. Επειδή το στρες έχει συνδεθεί με συνολική μείωση της πρωτεϊνοσύνθεσης, η ανάλυση της πρωτεϊνοσύνθεσης σε κύτταρα που υπερεκφράζουν την TIA1 αποκάλυψε σημαντική μείωση. Με βάση τα προαναφερθέντα αποτελέσματα και καθότι η ΤΙΑ1 είναι μία πρωτεΐνη με ιδιότητες ιοειδών, στη συνέχεια μελετήσαμε την πιθανή αλληλεπίδρασή της με το πρωτέωμα του κυττάρου. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε μια τεχνική στην οποία ένα ένζυμο σήμανσης, η υπεροξειδάση του ασκορβικού οξέος (APEX2), συγχωνευμένο με την ΤΙΑ1 επισημαίνει το δίκτυο αλληλεπίδρασης αυτής in vivo, επιτρέποντας την επακόλουθη ανάλυση ex vivo. Χρησιμοποιώντας αυτή την τεχνική, επισημάναμε όλους τους εταίρους της TIA1 σε απόσταση 20nm σε φυσιολογικές και σε συνθήκες με οξύ στρες. Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε φασματομετρία μάζας για την ταυτοποίησή τους και συν-ανοσοκατακρήμνιση με ανοσοστύπωμα κατά Western για να προσδιοριστούν πρωτεΐνες που συνδέονται άμεσα με την ΤΙΑ1. Το σύνολο των πρωτεϊνών που εντοπίστηκαν, τόσο σε συνθήκες ελέγχου όσο και σε συνθήκες στρες, σχετίζονται κυρίως με σύμπλοκα ριβονουκλεοπρωτεϊνών. Είναι αξιοσημείωτο ωστόσο, ότι το ρεπερτόριο των TIA1 - πρωτεϊνικών εταίρων ήταν εξαιρετικά ανόμοιο μεταξύ των δύο κυτταρικών καταστάσεων. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, το αλληλοεπιδρώμενο πρωτέωμα της TIA1 ήταν εμπλουτισμένο σε κυτταροπλασματικές διεργασίες που σχετίζονται με το μεταβολισμό του mRNA. Υπό συνθήκες στρες, οι επισημασμένοι με TIA1 εταίροι εμφάνισαν ευρύτερη υποκυτταρική κατανομή που περιλάμβανε τα χρωμοσώματα και τα μιτοχόνδρια. Συνολικά, τα δεδομένα αυτά αναδεικνύουν το χωροταξικό περιβάλλον της TIA1 με τους διαφορετικούς εταίρους της σε ποικίλες κυτταρικές καταστάσεις και ανοίγουν το δρόμο για τη διαλεύκανση του ρόλου του TIA1 σε αυτές τις διαδικασίες. Συμπερασματικά, στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής, παρουσιάζονται ισχυρά δεδομένα σχετικά με την επίδραση της ΤΙΑ1 σε μηχανισμούς που έχουν συνδεθεί με τη συσσωμάτωση και τη φωσφορυλίωση της α-συνουκλεΐνης και, αποκαλύπτεται το πρωτέωμα με το οποίο αλληλοεπιδρά η ΤΙΑ1, διευκολύνοντας τη περαιτέρω διερεύνηση και διαλεύκανση των μηχανισμών που σχετίζονται με την πιθανή δράση τόσο σε φυσιολογικές ή συνθήκες με οξύ στρες όσο και στη ΝΠ.