Προσδιορισμός φυσικών και συνθετικών αναστολέων αντλιών εκροής σε στελέχη Pseudomonas aeruginosa

Abstract

Multidrug resistant bacteria have become an extremely serious public health concern. Pseudomonas aeruginosa is a common cause of nosocomial infections and is classified as a priority pathogen by the World Health Organization due to its high resistance rate. Bacteria can develop resistance through various mechanisms. Drug extrusion by the multidrug efflux pumps represents an important mechanism of antimicrobial resistance. Inhibitors of bacterial efflux pumps as adjuvants in antibacterial therapy are a reasonable and cost-effective pursuit since the shortage of antibiotics threatens global human health. Combined use of synthetic or natural compounds with conventional antibiotics constitutes a promising alternative for fighting antibiotic resistance, as this could restore the activity of existing antibiotics. In the present study, the potential role of the natural compounds carvacrol and thymol and synthetic CuO, ZnO and CuZn nanoparticles as efflux pump inhibitors has been investigated against multidrug resistant strains of Pseudomonas aeruginosa. The mode of action of these compounds was evaluated by studying their synergistic activity in combination with the antibiotics meropenem, ciprofloxacin/levofloxacin and azithromycin at sub-inhibitory concentrations against efflux-pump over-expressed P. aeruginosa. The interaction of the combination was investigated by checkerboard microdilution method and time-kill curves. The compounds were further examined with real time fluorometry for the ethidium bromide (EtBr) uptake and efflux assay and membrane permeabilization. Also, their activity on the relative expression of mexA, mexB and mexC efflux pump genes and their ability to reduce the frequency of mutation was investigated. Their safety profile was evaluated in vitro by cytotoxicity (MTT, NR) and hemolysis assays. The results showed that both carvacrol, thymol and the tested nanoparticles act synergistically, in a concentration-dependent manner, with antibiotics known to be subject to efflux in P. aeruginosa reducing their MIC values. Furthermore, all the tested compounds at sub-inhibitory concentrations enhanced the intracellular accumulation of EtBr and reduced its efflux from the bacterial cells. The mechanism of their action can be explained by the reduction on the relative expression of the examined efflux pump genes. The antibiotic-EPIs combinations resulted in extended post-antibiotic effects. Furthermore, the natural inhibitors carvacrol and thymol reduced the frequency of mutant strains, and they did not display toxicity at concentrations needed to exert their activity. The synthetic nanoparticles showed toxicity except for the ZnO NPs which were biocompatible. These results suggest that both the natural compounds carvacrol, thymol and the synthetic nanoparticles may serve as potential sources of efflux pump inhibitors to tackle antimicrobial resistance.

Τα πολυανθεκτικά βακτήρια αποτελούν μια εξαιρετικά σοβαρή απειλή για τη δημόσια υγεία. Το βακτήριο Pseudomonas aeruginosa αποτελεί συχνή αιτία ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων και έχει ταξινομηθεί από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας ως επικίνδυνο παθογόνο εξαιτίας των υψηλών ποσοστών αντοχής που εμφανίζει. Τα βακτήρια μπορούν να αναπτύξουν αντοχή μέσω διαφόρων μηχανισμών. Η αποβολή φαρμάκων από τις αντλίες ενεργητικής εκροής αποτελεί έναν σημαντικό μηχανισμό μικροβιακής αντοχής. Οι αναστολείς αντλιών εκροής ως ενισχυτικά της υπάρχουσας αντιμικροβιακής θεραπείας είναι μια λογική και αποδοτική προσέγγιση, καθώς η έλλειψη νέων αντιβιοτικών απειλεί την παγκόσμια υγεία. Η συνδυαστική χορήγηση φυσικών ή συνθετικών ενώσεων μαζί με συμβατικά αντιβιοτικά αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική θεραπευτική λύση καθώς θα μπορούσε να επαναφέρει τη δράση αντιβιοτικών που δεν χρησιμοποιούνται λόγω αναποτελεσματικότητας. Στην παρούσα διατριβή, διερευνήθηκε ο ρόλος των φυσικών ενώσεων καρβακρόλη και θυμόλη και των συνθετικών νανοσωματιδίων CuO@PEG, ZnO@PEG και CuZn@TrEG ως αναστολείς των αντλιών εκροής σε πολυανθεκτικά στελέχη P. aeruginosa. Ο τρόπος δράσης τους αξιολογήθηκε με τη διερεύνηση της συνεργιστικής τους αλληλεπίδρασης σε συνδυασμό με τα αντιβιοτικά μεροπενέμη, σιπροφλοξασίνη/λεβοφλοξασίνη και αζιθρομυκίνη σε υπο-ανασταλτικές συγκεντρώσεις σε βακτηριακά στελέχη P. aeruginosa με ενεργό σύστημα εκροής. Η μεταξύ τους αλληλεπίδραση αξιολογήθηκε με τη μέθοδο checkerboard και τις καμπύλες κυτταρικού θανάτου. Οι φυσικές και συνθετικές ενώσεις διερευνήθηκαν με χρήση φθορισμόμετρου ως προς την ικανότητα να αναστέλλουν την εκροή της χρωστικής βρωμιούχου αιθιδίου (EtBr) και να προωθούν την ενδοκυτταρική της συγκέντρωση. Επίσης εξετάστηκε ο ρόλος τους στη βακτηριακή μεμβράνη, στη σχετική έκφραση των γονιδίων mexA, mexB και mexC των αντλιών εκροής MexAB-OprM και MexCD-OprJ αλλά και στην ικανότητα ταχείας ανάπτυξης αντοχής. Η ασφάλεια τους διερευνήθηκε in vitro με αναλύσεις τοξικότητας (MTT, NR) και τη δοκιμασία αιμόλυσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η καρβακρόλη και η θυμόλη αλλά και τα εξεταζόμενα νανοσωματίδια έχουν συνεργιστική δράση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, με αντιβιοτικά που υπόκεινται σε εκροή μειώνοντας τις τιμές MIC τους. Επιπλέον, όλες οι εξεταζόμενες ενώσεις σε υπο-ανασταλτική συγκέντρωση ενίσχυσαν την ενδοκυτταρική συσσώρευση του EtBr και μείωσαν την εκροή του από τα βακτηριακά κύτταρα. Ο μηχανισμός της δράσης τους μπορεί να εξηγηθεί από τη μείωση που παρατηρήθηκε στη σχετική έκφραση των εξεταζόμενων γονιδίων των αντλιών εκροής. Η συγχορήγηση των υποψήφιων αναστολέων με τις κινολόνες και την αζιθρομυκίνη είχε ως αποτέλεσμα παρατεταμένη μετα-αντιβιοτική δράση. Επιπλέον, οι φυσικοί αναστολείς καρβακρόλη και θυμόλη μείωσαν σημαντικά τη συχνότητα εμφάνισης ανθεκτικών μεταλλαγμάτων ενώ δεν παρουσίασαν τοξικότητα στις συγκεντρώσεις που απαιτούνται για να ασκήσουν τη δράση τους. Τα νανοσωματίδια εμφάνισαν τοξική δράση εκτός από τα νανοσωματίδια ZnO που ήταν πλήρως βιοσυμβατά. Τα παραπάνω αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι τόσο οι φυσικές ενώσεις καρβακρόλη και θυμόλη όσο και τα συνθετικά νανοσωματίδια μπορούν να αποτελέσουν πηγή αναστολέων αντλιών εκροής για την αντιμετώπιση της μικροβιακής αντοχής.