Μελέτη της έκφρασης των νευροδεσμασών (neuroligins) σε ανθρώπινα Τ-λεμφοκύτταρα σε υγιείς και ασθενείς με νοσήματα του κεντρικού νευρικού συστήματος: συσχετισμός της έκφρασής τους με την έκφραση των γλουταματεργικών υποδοχέων και της τροποποιητικής δράσης τους στον δίαυλο Kv1.3

Abstract

Genetic studies in autistic individuals have revealed a number of mutations in genes that control either the formation of synapses, such as neuroligins, or the excitability of the nerve cells, such as potassium channels. It is well known that mutations in neuroligins affect the expression levels of these genes while some of the mutations concerning potassium channels affect their biophysical properties. However, as with most Central Nervous System (CNS) disorders, only a very small percentage of autistic individuals have been identified with mutations even when there appears to be a family history. Alterations in gene expression or the functionality of gene products are caused not only by changes in the DNA sequence but also by chemical modifications of these bases or histone amino acids, the so-called epigenetic changes, which are infinitely more frequent of genetic mutations. In addition, epigenetic modifications that can occur at any time in a person's life in response to their environment, like genetic mutations, can be passed on to subsequent generations, thus explaining the finding of a family history in some cases but also the existence of individual cases (sporadic forms). Therefore, a logical next step was to ask whether epigenetic changes concerning these genes could be found in a percentage of individuals with ASD. For this purpose, the expression levels of neuroligins and the biophysical properties of the Shaker-type potassium channels which are involved in a large number of nerve cell functions were examined in autistic individuals. Given the inherent weakness of in vivo access to CNS cells and the existence of common mechanisms concerning the regulation of gene expression and intracellular communication in nervous and immune systems, we used freshly isolated T-lymphocytes from an easily accessible tissue taken from healthy individuals and subjects with CNS disorders such as Autism Spectrum Disorder. Considering that human T-cells, like neurons, form intracellular supramolecular structures analogous to the neural ones such as immunological synapses between T-cells and antigen-presenting cells, the possibility of neuroligin expression in human T-lymphocytes from peripheral blood of healthy individuals was initially examined. These experiments show for the first time the expression of neuroligins in human T-lymphocytes from healthy individuals at mRNA and protein level and that the expression neuroligin 3 (NLGN3) is subject to regulation by T-cell activation. Subsequently, the expression of these molecules in autistic individuals was examined and it was revealed that 53% of these individuals presented increased NLGN3 expression. It is noteworthy that this change in the expression level of this gene is in the same direction as would be expected if the individuals carried one of the gain-of-function mutations that have been reported in ASD. In addition, cells collected during the same blood donation were used immediately after their isolation (without cell culture-freshly isolated) for electrophysiological experiments where the biophysical properties of the main potassium channel of T-cells, namely Kv1.3 were studied. This channel belongs to the broad family of the Shaker family channels (Kν1.3) and is the main regulator of the quiescent and activated state of human T-cells. Patch clamp recordings demonstrated that 67% of autistic adults have peripheral blood T-lymphocytes that express Kv1.3 channels with a reduced ability to switch to the open state in order to allow the cell the potassium efflux necessary for proper function. In conclusion, the results of the present thesis a) demonstrate alterations in the expression and function of molecules with a key role in T-cell physiology in autistic adults, predicting and partially explaining findings in a large number of studies that reveal immune alterations in these individuals b) support the use of T-lymphocytes as a valuable ex vivo model for the study of cellular mechanisms in CNS disorders, thus not only revealing useful biomarkers for diagnostic reasons but also offering patient-specific therapeutic targets.

Γενετικές μελέτες σε άτομα που ανήκουν στο φάσμα του αυτισμού έχουν αποκαλύψει την ύπαρξη ενός αριθμού μεταλλαγών σε γονίδια τα οποία ελέγχουν είτε το σχηματισμό των συνάψεων, όπως οι νευροδεσμάσες, είτε τη διεγερσιμότητα των νευρικών κυττάρων, όπως οι δίαυλοι καλίου. Οι μεταλλαγές που έχουν εντοπιστεί στις νευροδεσμάσες (neuroligins) έχει δεχθεί ότι επηρεάζουν τα επίπεδα έκφρασης αυτών των γονιδίων ενώ κάποιες από τις μεταλλαγές που αφορούν στους διαύλους καλίου επιφέρουν αλλαγές στις βιοφυσικές τους ιδιότητες. Εν τούτοις, όπως και με τις περισσότερες διαταραχές του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ), μόνο σε ένα πολύ μικρό ποσοστό ατόμων με Διαταραχή Αυτιστικού Φάσματος (ΔΑΦ) έχουν εντοπιστεί μεταλλάξεις ακόμη και όταν φαίνεται να υπάρχει οικογενειακό ιστορικό. Όπως είναι πλέον γνωστό, αλλαγές στην γονιδιακή έκφραση ή τη λειτουργικότητα του κυττάρου δεν επιφέρουν μόνον οι αλλαγές στην ακολουθία των βάσεων του DNA αλλά και οι χημικές τροποποιήσεις των βάσεων αυτών ή/και των αμινοξέων των ιστονών, οι ονομαζόμενες επιγενετικές αλλαγές, οι οποίες και είναι απείρως συχνότερες των γενετικών μεταλλάξεων. Επιπλέον, οι επιγενετικές τροποποιήσεις που μπορούν να επέλθουν ανά πάσα στιγμή στη ζωή ενός ατόμου ως απάντηση στο περιβάλλον του, όπως και οι γενετικές μεταλλάξεις, δύνανται να μεταφερθούν στις επόμενες γενιές εξηγώντας έτσι την εύρεση οικογενειακού ιστορικού σε κάποιες περιπτώσεις αλλά και την ύπαρξη μεμονωμένων περιπτώσεων (σποραδικές μορφές). Με βάση τα παραπάνω δεδομένα σχηματίστηκε η υπόθεση ύπαρξης επιγενετικών αλλαγών στα παραπάνω γονίδια, σε ένα ποσοστό των ατόμων με ΔΑΦ. Για το σκοπό αυτό, αποφασίστηκε η διερεύνηση των επιπέδων έκφρασης των νευροδεσμασών και η μελέτη των βιοφυσικών ιδιοτήτων των διαύλων καλίου τύπου Shaker-οι οποίοι εμπλέκονται σε ένα μεγάλο αριθμό λειτουργιών των νευρικών κυττάρων- σε άτομα με ΔΑΦ. Με δεδομένη την ενδογενή αδυναμία της in vivo πρόσβασης κυττάρων του ΚΝΣ και τη γνώση από τη μεγάλη βιβλιογραφία αναφορικά με την ύπαρξη κοινών μηχανισμών ρύθμισης της έκφρασης γονιδίων και διακυτταρικής επικοινωνίας στο νευρικό και στο ανοσοποιητικό σύστημα, αποφασίστηκε η χρήση Τ-λεμφοκυττάρων από περιφερικό αίμα δηλαδή από μια εύκολα προσβάσιμη πηγή κυττάρων υγιών ατόμων αλλά και ατόμων με διαταραχές του ΚΝΣ όπως η ΔΑΦ. Αρχικά διερευνήθηκε η πιθανότητα έκφρασης των νευροδεσμασών στα Τ- λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος υγιών ατόμων βάσει του γεγονότος ότι και αυτά τα κύτταρα όπως και τα νευρικά σχηματίζουν διακυτταρικές υπερδομές ανάλογες των νευρικών, δηλαδή τις ανοσολογικές συνάψεις μεταξύ Τ-κυττάρων και αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων. Τα πειράματα αυτά ανέδειξαν για πρώτη φορά την έκφραση των νευροδεσμασών στα Τ-λεμφοκύτταρα υγιών ατόμων στο επίπεδο του mRNA και της πρωτεΐνης ενώ φάνηκε ότι η έκφραση μίας εξ αυτών, της NLGN3, υπόκειται σε ρύθμιση από το στάδιο ενεργοποίησης των Τ-κυττάρων. Ακολούθως, διερευνήθηκε η έκφραση αυτών των μορίων σε άτομα με ΔΑΦ όπου αποκαλύφθηκε ότι το 53% των ατόμων με αυτή τη διαταραχή παρουσιάζει αυξημένη έκφραση της NLGN3. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η αλλαγή στην έκφραση αυτού του γονιδίου είναι προς την ίδια κατεύθυνση με αυτή που θα αναμενόταν αν τα άτομα έφεραν μία από τις γενετικές μεταλλαγές όπως αυτή της αύξησης λειτουργίας (gain-of-function) που έχουν καταγραφεί στο γονίδιο αυτό στη ΔΑΦ. Επιπροσθέτως, κύτταρα που συλλέχθηκαν κατά την ίδια αιμοδοσία, χρησιμοποιήθηκαν αμέσως μετά την απομόνωσή τους (χωρίς δηλαδή τη διαμεσολάβηση κυτταροκαλλιεργειών) για ηλεκτροφυσιολογικά πειράματα όπου μελετήθηκαν οι βιοφυσικές ιδιότητες του κύριου διαύλου καλίου των Τ κυττάρων, γνωστού και ως Κv1.3. Ο εν λόγω δίαυλος ανήκει στην ευρεία οικογένεια των Shaker διαύλων και στα Τ-λεμφοκύτταρα έχει το ρόλο του κύριου ρυθμιστή της φυσιολογίας της ήρεμης και ενεργοποιημένης κατάστασης αυτών των κυττάρων. Πειράματα καθήλωσης τάσης κατέδειξαν ότι το 67% των ατόμων με ΔΑΦ παρουσιάζουν μείωση στο ύψος των Κv1.3 ρευμάτων κατά τη διάρκεια μεμβρανικής εκπόλωσης. Η συγκεκριμένη μείωση δεν οφείλεται στην έκφραση μικρότερου αριθμού διαύλων στη μεμβράνη των κυττάρων στα άτομα αυτά αλλά σε μείωση του αριθμού των διαύλων που μπορούν να μεταβούν στην αγώγιμη κατάσταση ώστε να υπάρξει η απαραίτητη εκροή καλίου για τη σωστή λειτουργία του κυττάρου. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής α) καταδεικνύουν την ύπαρξη αλλαγών στην έκφραση και τη λειτουργία μορίων με ρόλο-κλειδί στη φυσιολογία των Τ-λεμφοκυττάρων στα άτομα που βρίσκονται εντός του φάσματος του αυτισμού, β) προβλέπουν και εξηγούν εν μέρει τα ευρήματα ενός μεγάλου αριθμού μελετών που αναδεικνύουν την ύπαρξη αλλαγών στο ανοσοποιητικό σύστημα αυτών των ατόμων,γ) αναδεικνύουν τα Τ-λεμφοκύτταρα ως ένα πολύτιμο ex vivo μοντέλο για τη διερεύνηση και μελέτη κυτταρικών διαταραχών σε ασθένειες του κεντρικού νευρικού συστήματος, προσφέροντας έτσι όχι μόνον χρήσιμους για τη διάγνωση βιοδείκτες αλλά και αναδεικνύοντας εξατομικευμένους θεραπευτικούς στόχους.