Μελέτη της ρύθμισης των λειτουργιών των πρωτεϊνών της πυρηνικής μήτρας SAFB και LBR από την υποξία

Abstract

Oxygen deprivation (hypoxia) elicits the induction of an adaptive machinery that primarily involves transcriptional reprogramming mediated by Hypoxia Inducible Factors. However, there are lesser-known transcription-independent processes occurring at the onset of hypoxia. These include epigenetic marking, alterations in mRNA processing and functional nuclear organization. The nucleus is structurally characterized by a filamentous network, supporting chromatin, that comprises the nuclear matrix and lamina that are supported by proteins such as the Scaffold Attachment Factor B (SAFB) and Lamin B Receptor (LBR), respectively. In this study the aim was to investigate the function of both SAFB and LBR at the onset of hypoxia, as well as the role of these proteins in cellular response and adaptation to hypoxia. We have observed that at the onset of hypoxia there is a swift rearrangement of SAFB and LBR along the nuclear scaffold as observed by microscopy and biochemical fractionation. Furthermore, these events are HIF-independent and reversible upon reoxygenation. Immunoprecipitation experiments and proteomic analysis demonstrated that hypoxia alters SAFB1/2 interaction with vital components of splicing machinery, such as SF2 and SRPK1, and reduces LBR phosphorylation by SRPK1 and its association with nuclear envelope components such as lamin B. Moreover, these alterations are driven by the increased production of reactive oxygen species (ROS) occurring at hypoxia as a result of mitochondrial dysfunction. Hypoxia induced dissociation of SF2 and SRPK1 from SAFB nuclear matrix proteins leads to remodeling of splicing machinery and to increased cytoplasmic localization of SRPK1. The translocation of SRPK1 is regulated by ROS production and results in both reduced phosphorylation of the RS region of LBR and SR proteins, affecting the splicing procedure. Likewise, we have proved the SAFB, ROS-driven, involvement in the splicing regulation of genes that are associated with cellular adaptation to hypoxia. Overall, the data of the present study indicate new roles of the SAFB1/2 and LBR proteins in the remodeling of nuclear architecture and reprogramming of gene expression, as a quick cellular response to hypoxia.

Η απόκριση των κυττάρων στην έλλειψη οξυγόνου (υποξία) περιλαμβάνει την ύπαρξη προσαρμοστικών μηχανισμών, την δράση των οποίων διαμεσολαβούν οι επαγόμενοι από την υποξία μεταγραφικοί παράγοντες HIF (Hypoxia Inducible Factors). Ωστόσο υπάρχουν και άλλοι μηχανισμοί, λιγότερο γνωστοί, οι οποίοι είναι ανεξάρτητοι της μεταγραφής και ενεργοποιούνται στα πρώτα στάδια έκθεσης των κυττάρων/ιστών στην υποξία. Τέτοιοι μηχανισμοί περιλαμβάνουν την δράση επιγενετικών παραγόντων, την ρύθμιση της επεξεργασίας του RNA (μάτισμα) και την λειτουργική οργάνωση του πυρήνα. Ο πυρήνας των κυττάρων δομικά αποτελείται από ένα διάχυτο δίκτυο ινιδίων, το οποίο δρα υποστηρικτικά και σχηματίζει δομές όπως είναι η πυρηνική μήτρα και η πυρηνική λάμινα. Σημαντικό ρόλο διαδραματίζουν πρωτεΐνες των δομών αυτών, όπως είναι οι παράγοντες SAFB (Scaffold Attachment Factor B) και ο υποδοχέας της λαμίνης Β (Lamin B Receptor, LBR). Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνήθηκε η επίδραση της σύντομης έκθεσης κυττάρων σε υποξία στον εντοπισμό και την λειτουργία των πρωτεϊνών SAFB και LBR, καθώς και ο ρόλος των δύο αυτών πρωτεϊνών στην προσαρμογή και απόκριση των κυττάρων στην υποξία. Παρατηρήθηκε ότι η υποξία μεταβάλλει την υπο-πυρηνική κατανομή των πρωτεϊνών SAFB1/2 και LBR, οι οποίες, σύμφωνα με πειράματα βιοχημικής κλασμάτωσης, απομονώνονται σε διαλυτά πυρηνικά κλάσματα. Το φαινόμενο είναι ανεξάρτητο των HIF και αντιστρέφεται μετά από επανοξυγόνωση των κυττάρων. Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης και πρωτεομικής ανάλυσης υπέδειξαν αλλαγές στα πρωτεϊνικά σύμπλοκα σε συνθήκες υποξίας. Πιο συγκεκριμένα, οι SAFB παρουσιάζουν μειωμένη αλληλεπίδραση με πρωτεΐνες που σχετίζονται με την επεξεργασία του RNA, όπως είναι ο SF2 και η SRPK1, ενώ ο LBR δεσμεύεται λιγότερο στην λαμίνη Β και την SRPK1, η οποία είναι η κύρια κινάση που ρυθμίζει την φωσφορυλίωσή του. Στον μηχανισμό που επάγει την υπο-πυρηνική μετακίνηση των πρωτεϊνών SAFB και LBR εμπλέκονται οι δραστικές μορφές οξυγόνου (ROS) των οποίων η παραγωγή αυξάνεται κατά την έκθεση κυττάρων σε υποξία, ως αποτέλεσμα δυσλειτουργίας της αναπνευστικής αλυσίδας των μιτοχονδρίων. Κατά την υποξία, η αποδέσμευση των πρωτεϊνών SF2 και SRPK1 από τους παράγοντες SAFB οδηγεί σε αναδιοργάνωση των συμπλόκων ματίσματος και αύξηση του κυτταροπλασματικού εντοπισμού της SRPK1. Η μετακίνηση της SRPK1, ρυθμίζεται από τις δραστικές μορφές οξυγόνου και έχει ως αποτέλεσμα την μείωση της φωσφορυλίωσης της περιοχής RS του LBR αλλά και των παραγόντων ματίσματος SR, επηρεάζοντας έτσι την διαδικασία του ματίσματος. Επιπροσθέτως, αποδείχθηκε ότι οι SAFB συμμετέχουν στην ρύθμιση του εναλλακτικού ματίσματος γονιδίων που σχετίζονται με την κυτταρική προσαρμογή στην υποξία, με τρόπο που ρυθμίζεται από την ύπαρξη δραστικών μορφών οξυγόνου. Συνολικά τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης υποδεικνύουν την ύπαρξη ενός μηχανισμού γρήγορης απόκρισης των κυττάρων σε υποξία, στον οποίο εμπλέκονται οι πρωτεΐνες SAFB και LBR, επάγοντας την αναδιοργάνωση της πυρηνικής αρχιτεκτονικής και ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης.