Η λειτουργία της ανθρώπινης αγγειογενίνης στην αγγειογένεση

Abstract

Human angiogenin (hAng), an unusual member of the secreted ribonuclease family, is a potent angiogenic factor with a role in a variety of physiological and pathological conditions. hAng presents in normal human tissues and fluids, such as plasma, amniotic fluid, tumor microenvironment, and cerebrospinal fluid. It plays a major role in the growth and establishment of human tumors since it is a potent stimulator of new blood vessels through the process of angiogenesis. It is involved in each stage of oncogenesis, making it a diagnostic and prognosis cancer marker and a validated pharmaceutical target for drug development for human malignancies. The Ph.D. thesis mainly focuses on the interactions of hAng with proliferating cell nuclear antigens (PCNA). PCNA, the eukaryotic DNA sliding clamp, was first shown to act as a processivity factor of DNA polymerase δ, which is required for DNA synthesis during replication. However, besides DNA replication, PCNA functions are associated with other vital cellular processes such as chromatin remodeling, DNA repair, sister-chromatid cohesion, and cell cycle control. Molecular details of the hAng-PCNA interaction were determined by a combination of various biophysical methods. The two proteins were shown to interact directly, through immunoprecipitation (IP) studies of hAng with PCNA in vitro and their interaction was quantified by isothermal titration calorimetry (ITC), obtaining information on stoichiometry, enthalpy, entropy, and binding kinetics of the association. ITC experiments also revealed that the hAng-PCNA association is strong with a Kd value in the nanomolar range (Kd= 130 nM). Moreover, their interaction surface was mapped by NMR spectroscopy. Based on this information, we created a model of the 3D structure of the hAng-PCNA complex using docking and molecular dynamics simulations. The validity of the model was tested by mutating hAng residues Arg5 and Arg101, which are at the molecular interface of the two proteins and interact with PCNA residues Glu55 and Glu130, respectively. Thus, we generated a single and a double mutant of hAng, hAng R5E and R5ER101E, replacing the two arginines by glutamic acid. Subsequently, biophysical characterization of the interaction of each of the hAng variants PCNA by ITC experiments validated the model was since the hAng-PCNA interaction was converted from a strong association to a medium-strength association with Kd values of 218 nM and 1160 nM, for each variant, respectively. Recent studies have shown that phosphorylation of serine-threonine residues enables hAng to evade cytosolic ribonuclease inhibitor (RI) and enter the nucleus. Among the serine-threonine residues of hAng, four are of special interest, Ser87, which is at the molecular interface of the RI-hAng complex, and a cluster of three residues near the NLS, Ser28, Thr36, and Ser37. To investigate whether these residues contribute significantly to the conformation of hAng, crystallographic studies of the mutants hAng S28AT36AS37A and hAng S28AT36AS37AS87A were performed, wherevthese residues were replaced by alanine. The structural studies revealed that these mutations do not cause any significant change in the structure of hAng.

Η ανθρώπινη αγγειογενίνη (hAng), ένα ασυνήθιστο μέλος της οικογένειας των εκκρινόμενων ριβονουκλεασών, αποτελεί έναν ισχυρό αγγειογενετικό παράγοντα με ρόλο σε μια πληθώρα τόσο φυσιολογικών, όσο και παθολογικών καταστάσεων. Η hAng εμφανίζεται σε φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς και υγρά, όπως το πλάσμα, το αμνιακό υγρό και το εγκεφαλονωτιαίο υγρό, ενώ παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εγκαθίδρυση ανθρώπινων όγκων, καθώς διεγείρει την ανάπτυξη νέων αιμοφόρων αγγείων μέσω της διαδικασίας της αγγειογένεσης. Επίσης, εμπλέκεται σε κάθε στάδιο της ογκογένεσης, αποτελώντας ένα διαγνωστικό και προγνωστικό καρκινικό δείκτη και επικυρωμένο φαρμακευτικό στόχο για την ανάπτυξη φαρμάκων στην αντιμετώπιση νεοπλασιών. Η διδακτορική διατριβή εστιάζεται κυρίως στις αλληλεπιδράσεις της hAng με το πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA). Το PCNA ανήκει στην οικογένεια των πρωτεϊνών του ολισθαίνοντος σφιγκτήρα του DNA (DNA sliding clamp) και λειτουργεί ως βοηθητική πρωτεΐνη της πολυμεράσης-δ, ώστε αυτή να προσδεθεί στο DNA και να πραγματοποιηθεί η αντιγραφή του. Ακόμη, παίζει σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό των νουκλεϊκών οξέων, είναι απαραίτητο για την αντιγραφή και την επιδιόρθωση βλαβών του DNA, συμμετέχει στη συγκρότηση της χρωματίνης, στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, στην απόπτωση και εμπλέκεται στη μεταγραφή του RNA. Οι μοριακές λεπτομέρειες της αλληλεπίδρασης της hAng με το PCNA προσδιορίστηκαν με συνδυασμό διάφορων μεθόδων βιοφυσικής. Μέσω μελετών ανοσοκατακρήμνισης (IP) της hAng με το PCNA in vitro, αποδείχθηκε πως οι δύο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν άμεσα, ενώ η αλληλεπίδραση ποσοτικοποιήθηκε με θερμιδομετρία ισοθερμικής τιτλοδότησης (ITC), λαμβάνοντας πληροφορίες σχετικά με τη στοιχειομετρία, την ενθαλπία, την εντροπία και την κινητική σχηματισμού του συμπλόκου των δύο πρωτεϊνών, αποκαλύπτοντας πως πρόκειται για μία ισχυρή αλληλεπίδραση με σταθερά διάστασης Kd= 130 nM. Ακόμη, πραγματοποιήθηκε χαρτογράφηση της επιφάνειας αλληλεπίδρασης τους με φασματοσκοπία NMR, ενώ βάσει των παραπάνω πληροφοριών δημιουργήθηκε ένα μοντέλο της τρισδιάστατης δομής του συμπλόκου hAng-PCNA, με τη βοήθεια αλγορίθμων ελλιμενισμού (docking) και προσομοιώσεων μοριακής δυναμικής. Η σταθερότητα της αλληλεπίδρασης ελέγχθηκε με τη δημιουργία μεταλλάξεων των καταλοίπων της hAng, Arg5 και Arg101 που βρίσκονται, σύμφωνα με το μοντέλο, στην επιφάνεια διεπαφής των δύο πρωτεϊνών και αλληλεπιδρούν με τα κατάλοιπα του PCNA, Glu55 και Glu130 αντίστοιχα. Παράχθηκαν έτσι, δύο μεταλλάγματα (R5E και R5ER101E), όπου οι δύο αργινίνες αντικαταστάθηκαν από γλουταμικό οξύ. Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκε βιοφυσικός χαρακτηρισμός της αλληλεπίδρασης των μεταλλαγμάτων της hAng με το PCNA, με ITC. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την ορθότητα του μοντέλο, καθώς η αλληλεπίδραση του συμπλόκου hAng-PCNA, μετά την αλλαγή των συγκεκριμένων αμινοξέων, μετατράπηκε από μια ισχυρή σε μία μεσαία αλληλεπίδραση με σταθερές διάστασης, Kd= 218 nM και Kd= 1160 nM, για τα μεταλλάγματα R5E και R5ER101E, αντίστοιχα. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν πως η φωσφορυλίωση καταλοίπων σερίνης-θρεονίνης δίνει στην hAng τη δυνατότητα να αποφεύγει τον κυτοσολικό αναστολέα ριβονουκλεασών (RI) και να εισέρχεται στον πυρήνα. Μεταξύ των καταλοίπων σερίνης-θρεονίνης της hAng παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον, η σερίνη 87, που βρίσκεται στη μοριακή επιφάνεια του συμπλόκου RI-hAng και τρία κατάλοιπα κοντά στην αλληλουχία πυρηνικού εντοπισμού (NLS), οι σερίνες 28 και 37 και η θρεονίνη 36. Με στόχο τη διερεύνηση της συμβολής των καταλοίπων αυτών στη δομή της hAng διεξήχθησαν κρυσταλλογραφικές μελέτες των μεταλλαγμάτων hAng S28AT36AS37A και hAng S28AT36AS37AS87A, όπου τα παραπάνω κατάλοιπα αντικαταστάθηκαν από αλανίνη, οι οποίες αποκάλυψαν πως οι συγκεκριμένες μεταλλάξεις δεν αλλάζουν σημαντικά τη δομή της πρωτεΐνης.