Διερεύνηση του ρόλου της GemC1/Lynkeas στον καθορισμό της κυτταρικής μοίρας των πρόδρομων νευρικών κυττάρων του εγκεφάλου

Abstract

Hydrocephalus is a chronic, neurological condition caused by an abnormal accumulation of cerebrospinal fluid within the brain ventricles, resulting in pressure on the brain. Environmental causes such as intraventricular hemorrhages induce hydrocephalus development, while few genetic factors have been directly linked to the human disease. Studies in rodents have contributed to the identification of new genes responsible for hydrocephalus, most of which are implicated in brain ependymal cells’ functions. Ependymal cells are specialized epithelial cells lining the walls of the brain ventricles. These cells bear multiple cilia on their apical surface, which beat in a coordinated fashion in order to circulate the cerebrospinal fluid throughout the ventricular system of the brain. Together with the adult neural stem cells, they consist two of the most important cell populations of the subventricular zone neurogenic niche. Recent findings from our laboratory highlight the importance of the GemC1 protein in multiciliated ependymal cells’ generation. Deletion of GemC1 in mice results in the complete absence of the brain ependymal cells and the development of hydrocephalus.Here we show that GemC1 is a critical regulator of neural stem cells commitment towards the ependymal or the adult neural stem cell lineage. Our results show that deletion of GemC1 impedes neural stem cells commitment towards the ependymal cells and promotes their differentiation to adult neural stem cells. These cells are actively proliferating and possess neurogenic potential. Furthermore, single cell deletion of GemC1 revealed that the cellular changes we observed in the absence of GemC1 are not triggered by hydrocephalus occurrence, but rather suggest that GemC1 functions in a cell-autonomous manner. Given the pivotal role that GemC1 and McIdas proteins possess in cell fate commitment and differentiation of multiciliated cells, we examined whether their overexpression could induce the reprogramming of different cell types of the brain towards the ependymal cell lineage, employing ex vivo and in vivo approaches. We provided evidence that McIdas ectopic expression in ex vivo cultured cortical astrocytes promotes their reprogramming to functional multiciliated ependymal cells. In addition, McIdas overexpression in periventricular brain cells of mice with induced hemorrhagic hydrocephalus led to their reprogramming towards mature ependymal cells. Taking advantage of the GemC1 knockout transgenic mouse line, which represent a genetic mouse model of hydrocephalus, we examined whether in vivo overexpression of GemC1 and McIdas could promote reprogramming to ependymal cells, assessing molecular markers and functional characteristics of the ependymal cells. Our data showed that in vivo overexpression of GemC1 and McIdas have similar effect on the early stages of the differentiation process towards the ependymal cells and McIdas is capable of inducing reprogramming to fully functional ependymal cells.Together, these findings suggest that GemC1 is a key-molecule for the balanced generation of ependymal and adult neural stem cells in the brain. Moreover, our results propose GemC1 and McIdas as potential reprogramming factors in cell-based therapy approaches for hydrocephalus treatment.

Η υδροκεφαλία είναι μια χρόνια νευρολογική πάθηση που προκαλείται από τη μη φυσιολογική συσσώρευση εγκεφαλονωτιαίου υγρού στις κοιλίες του εγκεφάλου με συνέπεια την αύξηση της ενδοκρανιακής πίεσης. Εξωγενείς παράγοντες όπως η ύπαρξη αιμορραγίας στο σύστημα των κοιλιών οδηγούν σε υδροκεφαλία, ενώ λίγοι είναι οι γενετικοί παράγοντες που έχουν σχετιστεί άμεσα με την ανθρώπινη ασθένεια. Έρευνες σε πειραματικά μοντέλα τρωκτικών έχουν αναδείξει νέα υπεύθυνα γονίδια, πολλά εκ των οποίων εμπλέκονται στη λειτουργία των επενδυματικών κυττάρων του εγκεφάλου. Τα επενδυματικά κύτταρα αποτελούν εξειδικευμένα επιθηλιακά κύτταρα που καλύπτουν τα τοιχώματα των κοιλιών του εγκεφάλου και φέρουν πολυάριθμους κροσσούς στην επιφάνειά τους, η συντονισμένη κίνηση των οποίων εξασφαλίζει την κυκλοφορία του εγκεφαλονωτιαίου υγρού στις κοιλίες. Μαζί με τα ενήλικα νευρικά βλαστικά κύτταρα αποτελούν τους σημαντικότερους πληθυσμούς της νευρογενετικής φωλεάς της υποκοιλιακής ζώνης του εγκεφάλου. Πρόσφατη δημοσίευση του εργαστηρίου ανέδειξε τη σημασία της πρωτεΐνης GemC1 στη δημιουργία των πολυκροσσωτών επενδυματικών κυττάρων, καθώς η απαλοιφή της σε μυς οδηγεί σε απώλεια των επενδυματικών κυττάρων και υδροκεφαλία. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας αναδεικνύουν το ρόλο του παράγοντα GemC1 ως ένα μόριο-ρυθμιστή στη διαδικασία κυτταρικού καθορισμού των νευρικών βλαστικών κυττάρων του εγκεφάλου προς τη μοίρα των επενδυματικών ή των ενήλικων νευρικών βλαστικών κυττάρων. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η απουσία του GemC1 αναστέλλει τον καθορισμό της μοίρας των νευρικών βλαστικών κυττάρων του εγκεφάλου προς επενδυματικά κύτταρα και επάγει τη διαφοροποίησή τους προς ενήλικα νευρικά βλαστικά κύτταρα. Τα κύτταρα αυτά φαίνεται ότι αποτελούν ενεργά πολλαπλασιαζόμενα βλαστικά κύτταρα με την ικανότητα νευρογένεσης. Επιπρόσθετα, πραγματοποιώντας απαλοιφή του GemC1 σε επίπεδο ενός κυττάρου φάνηκε ότι αυτές οι κυτταρικές αλλαγές δε συνδέονται με το φαινότυπο της υδροκεφαλίας, αλλά αντίθετα προτείνουν ότι η δράση του GemC1 στηρίζεται σε μηχανισμούς αυτόνομης κυτταρικής ρύθμισης. Στη συνέχεια, εξετάσαμε αν οι πρωτεΐνες GemC1 και McIdas, βάσει του κομβικού ρόλου τους στον κυτταρικό καθορισμό και τη διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων, μπορούν να επάγουν τoν επαναπρογραμματισμό κυττάρων του εγκεφάλου προς επενδυματικά κύτταρα μέσω της υπερέκφρασής τους, αξιοποιώντας τόσο ex vivo όσο και in vivo συστήματα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η εκτοπική έκφραση του McIdas σε ex vivo καλλιέργεια αστροκυττάρων του εγκεφαλικού φλοιού οδηγεί στον επαναπρογραμματισμό τους προς λειτουργικά πολυκροσσωτά επενδυματικά κύτταρα. Ακόμη, η υπερέκφραση του McIdas στα περικοιλιακά κύτταρα του εγκεφάλου μυών με επαγόμενη αιμορραγική υδροκεφαλία είχε σαν αποτέλεσμα τον επαναπρογραμματισμό τους προς ώριμα επενδυματικά κύτταρα. Τέλος, εκμεταλλευόμενοι τoυς ελλειμματικούς για το GemC1 μυς, ως ένα γενετικό μοντέλο υδροκεφαλίας, εξετάσαμε τα αποτελέσματα της in vivo υπερέκφρασης των GemC1 και McIdas στον επαναπρογραμματισμό, αξιολογώντας μοριακούς δείκτες και λειτουργικά χαρακτηριστικά των επενδυματικών κυττάρων. Η μελέτη μας έδειξε ότι η in vivo υπερέκφραση των GemC1 και McIdas έχει παρόμοια αποτελέσματα στα αρχικά στάδια της διαφοροποίησης προς επενδυματικά κύτταρα και ο McIdas είναι ικανός να επάγει τον επαναπρογραμματισμό προς λειτουργικά επενδυματικά κύτταρα.Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν την πρωτεΐνη GemC1 ως μόριο-κλειδί στη διατήρηση της ισορροπίας παραγωγής των επενδυματικών και των ενήλικων νευρικών βλαστικών κυττάρων του εγκεφάλου. Επιπλέον, τα δεδομένα μας προτείνουν τις πρωτεΐνες McIdas και GemC1 σαν δυνητικούς παράγοντες επαναπρογραμματισμού, που θα μπορούσαν βρουν εφαρμογή ως μέσο κυτταρικής θεραπείας στην ασθένεια της υδροκεφαλίας.