Νέες προσεγγίσεις στη ρύθμιση και λειτουργία του κ-οπιοειδούς υποδοχέα

Abstract

The molecular mechanisms that govern anxiety, depression and associated stress-related neural responses and pathologies are poorly understood. Opioid receptors (μ-ΟR, δ-ΟR and κ-OR) regulate motivational processes and are important players in psychiatric disorders. Accumulating evidence suggests that κ-ΟR antagonists and δ-ΟR agonists exert promising antidepressant potential. Consistent with these findings the κ-ΟR and its endogenous neuropeptide ligand dynorphin A were found to play a key role in modulating stress and mood and specific κ-ΟR antagonists are currently in phase III clinical trials. Opioid receptors and their complex signalling are known to regulate neuronal plasticity and neurotransmission; however, the underlying mechanisms remain as yet, unclarified. A growing body of evidence indicates that systemic administration of κ-ΟR ligands produces mood altering effects in classical models of depression. Notably, κ-ΟR agonists and antagonists showed depressant and antidepressant effects respectively, in the forced swim test and learned helplessness in rats. Stress blocks LTP through release of endogenous opioids, a finding supporting previous observations that stress is accompanied by release of the endogenous κ-OR agonist dynorphin and subsequent activation of the κ-ΟR with an as yet unknown mechanism. Emerging evidence suggests that G protein-coupled receptors (GPCRs) are direct sensors involved in regulation of the autophagic machinery while autophagy is recently shown to regulate synaptic morphogenesis and function. Αutophagy is a regulated process for degradation of cytosolic components and organelles through delivery to lysosomes. Its primary role is to ensure cell survival under stress conditions. In neurons, basal levels of autophagy help to control the cellular quality of proteins and protect cells from protein aggregation. Recent results suggest that autophagy regulates the development and function of axons, dendrites and synapses whereas, insufficient or excessive neuronal autophagy contributes to pathological changes in these structures. Autophagy alters the kinetics and neurotransmitter release and the density of synaptic vesicles. The modulation of vesicle numbers or evoked neurotransmitter release by presynaptic autophagy may contribute to synaptic plasticity mechanisms such as synaptic potentiation and depression. Autophagy has also been implicated in the degradation of postsynaptic receptors such as GABAA and AMPA receptors. Moreover, it was previously demonstrated that activation of the δ-ΟR with selective agonists is implicated in the regulation of neuronal differentiation, neurite outgrowth and survival through the formation of a dynamic protein complex “signalosome” composed of Gi/o, RGS proteins transcription factors and the neuronal protein spinophilin. Using in vitro and in vivo studies, this study aims to clarify the potential role of autophagy and κ-opioid receptor (κ-OR) signaling on synaptic structure and integrity. We hereby demonstrate that the selective κ-opioid receptor (κ-OR) agonist, U50,488H and the endogenous neuropeptide dynorphin induce autophagy in a time-and dose-dependent manner in neuronal cells by upregulating microtubule-associated protein light chain 3-II (LC3-II), Beclin 1, Atg5 and reducing p62 protein levels. Moreover, pre-treatment of neuronal cells with pertussis toxin blocked the above κ-OR-mediated cellular changes, indicating the involvement of Gi/o proteins in the κ-OR effects. Our molecular analysis also revealed a κ-OR-driven upregulation of becn1 gene through ERK1,2-dependent activation of the transcription factor CREB in neuronal cells. Our in vivo studies demonstrate that mice treated with U50,488H displayed profound increases of specific autophagic markers in the hippocampus with a concomitant decrease of several pre- and post-synaptic proteins such as spinophilin, PSD-95 and SNAP25, which interact with LC3, suggesting that these proteins are plausibly engulfed in the κ-OR-induced autophagic cargo. Αlso, using acute stress (force swim), a stimulus known to trigger synaptic loss and also increase levels of the natural ligand of κ-OR, dynorphin, we demonstrated that the administration of the κ-ΟR selective antagonist, nor-binaltorhimine (norBNI) before stress blocked the stress-evoked reduction of synaptic protein and the accompanied induction of autophagy in the hippocampus. Finally, pre-treatment of neuronal cells with the κ-ΟR antagonist CERC-501, which is at clinical phase III as anxiolytic drug, inhibits κ-OR mediated autophagy in vitro. These findings provide novel insights about the essential role of autophagic machinery into the mechanisms through which κ-OR and its signaling regulated brain plasticity. Elucidating these molecular mechanisms will revolutionize disease diagnosis, allow the identification of new therapeutic targets and lead to the discovery of novel therapeutic agents and effective treatments.

Οι οπιοειδείς υποδοχείς (μ-ΟR, δ-ΟR και κ-OR) ανήκουν στην υπεροικογένεια των υποδοχέων που συζευγνύονται με τις G πρωτεΐνες (GPCRs), οι οποίοι κατανέμονται στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα και ρυθμίζουν διεργασίες που σχετίζονται με τη διάθεση και το αίσθημα ανταμοιβής. Οι κ-οπιοειδείς υποδοχείς (κ-ORs) εκφράζονται ευρέως σε όλο το κεντρικό νευρικό σύστημα και ενεργοποιούνται από ειδικά ενδογενή οπιοειδή που προέρχονται από το γονίδιο της προδυνορφίνης και από εξωγενείς προσδέτες. Οι αγωνιστές των κ-οπιοειδών υποδοχέων προκαλούν δυσφορία, ανηδονία και καταθλιπτικές συμπεριφορές σε ανθρώπους και μοντέλα τρωκτικών ενώ οι ανταγωνιστές του κ-OR αποτρέπουν τις συμπεριφορικές αποκρίσεις που προκαλούνται από το στρες. Για το λόγο αυτό το ενδογενές σύστημα δυνορφίνης/κ-OR παίζει πολύ σημαντικό ρόλο σε διαταραχές της διάθεσης όπως ο εθισμός, το άγχος και η κατάθλιψη. Ο κ-OR προσδένεται με τις πρωτεΐνες Gi/o για να ρυθμίσει καθοδικά μόρια τελεστές όπως η αδενυλική κυκλάση, οι διαύλοι K+/Ca+2, η φωσφολιπάση C και οι ΕRK 1,2 κινάσες επηρεάζοντας έτσι την μεταγραφή γονιδίων και την κυτταρική φυσιολογία. Έχει αποδειχθεί ότι ένας αριθμός διαφορετικών GPCRs ρυθμίζει την αυτοφαγία, μέσω διαφορετικών μηχανισμών. Η αυτοφαγία αποτελεί έναν ομοιοστατικό μηχανισμό αποικοδόμησης κυτταροπλασματικού υλικού μέσω των λυσοσωμάτων και στο νευρικό κύτταρο ρυθμίζει την ανάπτυξη, τη λειτουργία των αξόνων, των δενδριτών και των συνάψεων. Ανεπαρκής ή υπερβολική αυτοφαγία στους νευρώνες συμβάλλει σε εκφυλισμό αυτών των δομών οδηγώντας σε παθολογικές αλλαγές. Η αυτοφαγία μεταβάλλει επίσης την κινητική της απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστών και την πυκνότητα των συναπτικών κυστιδίων συμβάλλοντας έτσι σε μηχανισμούς συναπτικής πλαστικότητας. Η παρούσα εργασία έχει ως πρώτο στόχο να διερευνήσει εάν η ενεργοποίηση του κ-οπιοειδούς υποδοχέα από εξειδικευμένα, εξωγενή ή ενδογενή πεπτίδια, όπως το U50,488H και η Δυνορφίνη1-13, αντίστοιχα, ρυθμίζουν τον μηχανισμό της αυτοφαγίας στους νευρώνες in vitro και in vivo. Επιπλέον, να ελέγξει τις αλλαγές που παρατηρούνται σε διάφορες συναπτοσωμικές πρωτεΐνες και στη μορφολογία των νευρώνων. Eπιπλέον ως δεύτερο στόχο έχει να προσδιορίσει το μοριακό μονοπάτι μέσω του οποίου ο ενεργοποιημένος κ-ΟR ρυθμίζει τον αυτοφαγικό μηχανισμό και να διερευνήσει τυχόν αλλαγές που προκαλούνται στην έκφραση αυτοφαγικών γονιδίων. Τέλος, με γνώμονα το γεγονός ότι, το ενδογενές σύστημα δυνορφίνης/κ-ΟR ενεργοποιείται σε καταστάσεις άγχους και κατάθλιψης ένας σημαντικός και τρίτος στόχος της μελέτης μας είναι να διερευνήσει αν το οξύ στρες ενεργοποιεί την αυτοφαγία μέσω του κ-ΟR και επηρεάζει τις συνάψεις. Τα πειραματικά δεδομένα της παρούσας διατριβής δηλώνουν ότι έκθεση νευρωνικών κυττάρων στον αγωνιστή του κ-OR, U50,488H και στο ενδογενές νευροπεπτίδιο δυνορφίνη, οδηγούν στην αύξηση κομβικών αυτοφαγικών δεικτών με δόσο- και χρόνο- εξαρτώμενο τρόπο. Η επίδραση αυτή αντιστρέφεται από επιλεκτικούς ανταγωνιστές του κ-OR. Οι πρωτεΐνες Gi/o και ERK1,2 κινασες είναι υπεύθυνες για την U50,488H-επαγόμενη αυτοφαγία. Ένα ενδιαφέρον εύρημα της μελέτης μας ήταν ότι η εξαρτώμενη από την U50,488H ενεργοποίηση του CREB ρυθμίζει τη μεταγραφή του προαυτοφαγικού γονιδίου becn1, επιβεβαιώνοντας ότι ο κ-ΟR οδηγεί σε αύξηση της μεταγραφής συγκεκριμένων αυτοφαγικών γονιδίων. Αναστολή των ERK1,2 κινασών αποτρέπει την U50,488H-εξαρτώμενη φωσφορυλίωση του CREB, δηλώντας ότι τα σημαντικότερα καθοδικά σηματοδοτικά συστατικά που συμμετέχουν στην επαγόμενη από τον κ-ΟR αυτοφαγία εκτός από τις Gi/o και ERK1,2 κινάσες περιλαμβάνουν και τον μεταγραφικό παράγοντα CREB, ο οποίος προσδένεται στον υποκινητή διαφόρων αυτοφαγικών γονιδίων. Ιn vivo πειράματα, ύστερα από χορήγηση του U50,488H, έδειξαν ότι η επαγόμενη από τον κ-ΟR αυτοφαγία εμφανίζεται μόνο στον ιπποκάμπο και όχι στο ραβδωτό και το φλοιό όπως αποδεικνύεται με τα αυξημένα επίπεδα των αυτοφαγικών δεικτών LC3-II και Beclin1. Επιπλέον, η χορήγηση U50,488H σε μύες οδήγησε στην αποικοδόμηση των βασικών συναπτικών πρωτεϊνών όπως οι σπινοφιλίνη, PSD95 και SNAP25 μόνο στον ιππόκαμπο. Οι πρωτεΐνες αυτές συμμετέχουν στην αναδιαμόρφωση και λειτουργία των δενδριτικών ακάνθων και με βάση τα ευρήματα της παρούσας μελέτης βρέθηκε ότι αλληλεπιδρούν με την πρωτεϊνη LC3 καθώς εντοπίζονται στο εσωτερικό απομονωμένων αυτοφαγοσωμάτων. Επιπλέον, η αναστολή της αυτοφαγίας δεν οδήγησε σε μείωση των συναπτοσωμικών πρωτεϊνών συμπεραίνοντας ότι η αποικοδόμηση αυτών των πρωτεϊνών οφείλεται στην εσωτερίκευσή τους στα αυτοφαγοσώματα. Πρωτογενείς καλλιέργειες νευρώνων έδειξαν επίσης ότι η ενεργοποίηση του κ-ΟR μειώνει τον αριθμό των διακλαδώσεων των νευριτών στον ιππόκαμπο αποδεικνυώντας ότι η ενεργοποίηση της αυτοφαγίας επηρεάζει άμεσα την μορφολογία των νευρώνων. Ένα άλλο ενδιαφέρον αποτέλεσμα της παρούσας μελέτης ήταν ότι η εξαναγκασμένη κολύμβηση (FST) σε μύες οδήγησε στην επαγωγή της αυτοφαγίας. Η επίδραση αυτή αναστέλλεται με τη χορήγηση του ειδικού ανταγωνιστή του κ-OR, nor-BNI. Τέλος, ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η χορήγηση του nor-BNI σε μύες σε καταστάσεις στρες, οδηγεί στην μείωση της σπινοφιλίνης, της PSD-95 και της SNAP-25, στον ιππόκαμπο αλλά όχι στον φλοιό των ζώων που υποβλήθηκαν σε στρες. Τα αποτελέσματα αυτά δηλώνουν ότι κάτω από συνθήκες οξέος στρες, η απελευθέρωση της δυνορφίνης ενεργοποιεί τον αυτοφαγικό μηχανισμό που οδηγεί σε συναπτοσωμικές μεταβολές στον ιππόκαμπο. Η ταχέως αναπτυσσόμενη βιβλιογραφία σχετικά με την λειτουργία του κ-OR εστιάζει το ενδιαφέρον της στην ανάπτυξη ανταγωνιστών του υποδοχέα για νέες θεραπευτικές αγωγές για την κατάθλιψη και τις αγχώδεις διαταραχές, καθώς και για τη ρύθμιση του στρες και τη μείωση της δυσφορίας σε καταστάσεις εθισμού. Τα αποτελέσματα μας παρουσιάζουν ένα νέο σηματοδοτικό μονοπάτι του κ-OR, όπου οι επιλεκτικοί προσδέτες του μπορούν να ρυθμίζουν την αυτοφαγία και να προκαλούν αλλαγές στις συνάψεις σε καταστάσεις οξέος στρες. Τα ευρήματα αυτά μπορούν επίσης να εξηγήσουν τον τρόπο δράσης των ειδικών κ-οπιοειδών ανταγωνιστών που βρίσκονται σήμερα σε κλινικές δοκιμές φάσης ΙΙI για τη θεραπεία νευροψυχιατρικών διαταραχών λόγω του στρες. Τα αποτελέσματα της παρούσης διατριβής θα διευρύνουν την υφιστάμενη γνώση που υπάρχει σε σχέση με την λειτουργικότητα και το ρόλο που παίζει ο κ-OR σε θέματα που αφορούν αλλαγές στην νευρωνική πλαστικότητα και θα βοηθήσει στον προσδιορισμό νέων φαρμακολογικών παραγόντων και στόχων για την καταπολέμηση των νευροψυχιατρικών παθήσεων που σχετίζονται με το άγχος και την κατάθλιψη.