Διερεύνηση μολυσματικών πρωτεϊνών φυτικών παθογόνων μέσω δομικών και λειτουργικών προσεγγίσεων

Abstract

Plant-microbe molecular interactions is an important research field, the understanding of which can lead to the design of more successful new strategies for sustainable food production. The scientific community has considered the structural approach of protein-protein interactions between a pathogen and its host targets to a limited extent. However, significant progress has been made in this area due to the rapid development of artificial intelligence programs capable of predicting the tertiary structure of a protein and, as a result, further deepening and generating hypotheses on the functional characterization of proteins.The general reasoning and experimental design of this thesis is presented in Chapter One: Introduction, where the basic theory for the conservation of the protein structures of effectors having similar functions within the host cell is described. A first application of the tertiary structure calculation and correlation programs to the function of potential infectious protein factors and their ability to induce programmed cell death by two strains (Temecula1, CoDiRo) and a subspecies (Sandyi Ann-1) of the plant pathogen Xylella fastidiosa.In addition, this PhD thesis presents the results from the structural analyses and functional characterizations of the type 3 secretion system effectors XopP and RipE1 of the pathogens Xanthomonas campestris pv. campestris and Ralstonia solanacearum respectively, in the subunit Exo70B1 of the exocytosis complex of the plant host Arabidopsis thaliana. The XopP effector, as deduced from in vivo and in vitro analyses, exhibits kinase function, whereas the RipE1 effector, previously characterized as a cysteine protease, has the ability to cleave the Exo70B1 protein in vitro.Overall, this thesis combines a number of techniques and methods from different areas of biological science (bioinformatics, molecular biology techniques, structural biology techniques, biophysics/biochemistry assays) and presents an experimental design for the functional characterization of protein molecules.

Οι μοριακές αλληλεπιδράσεις φυτών-μικροβίων είναι ένα σημαντικό ερευνητικό πεδίο, η κατανόηση του οποίου μπορεί να οδηγήσει τόσο στο σχεδιασμό πιο επιτυχημένων νέων στρατηγικών για μια βιώσιμη παραγωγή τροφίμων, όσο και στην κατανόηση των βασικών βιολογικών μηχανισμών που καθορίζουν τις αλληλεπιδράσεις αυτές σε μοριακό επίπεδο. Ωστόσο, η δομική προσέγγιση των μοριακών αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, μεταξύ ενός παθογόνου και των στόχων του στον ξενιστή, δεν έχει μελετηθεί σε μεγάλος βάθος από την επιστημονική κοινότητα. Η σημαντική πρόοδος που έχει επιτευχθεί τα τελευταία χρόνια λόγω της ραγδαίας ανάπτυξης προγραμμάτων τεχνητής νοημοσύνης, τα οποία είναι ικανά να προβλέπουν την τριτοταγή δομή μιας πρωτεΐνης και ως αποτέλεσμα, την περαιτέρω εμβάθυνση και δημιουργία υποθέσεων σχετικά με τον λειτουργικό χαρακτηρισμό των πρωτεϊνών, μπορεί να βοηθήσει αλλάζοντας δραματικά τους τρόπους προσέγγισης και μελέτης στο πεδίο αυτό.Ο γενικότερος συλλογισμός και πειραματικός σχεδιασμός της παρούσας διατριβής παρουσιάζεται στο πρώτο Κεφάλαιο: «Εισαγωγή», όπου περιγράφεται η βασική θεωρία για τη συντήρηση των πρωτεϊνικών δομών των τελεστών που έχουν όμοιες λειτουργίες εντός του κυττάρου του ξενιστή, ενώ γίνεται μια πρώτη εφαρμογή των προγραμμάτων υπολογισμού τριτοταγούς δομής πρωτεϊνών, και συσχέτισης της με τη λειτουργία πιθανών μολυσματικών πρωτεϊνικών παραγόντων και την ικανότητα τους να επάγουν προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο από δύο στελέχη (Temecula1, CoDiRo) και ένα υποείδος (Sandyi Ann-1) του φυτικού παθογόνου καραντίνας Xylella fastidiosa.Επιπροσθέτως, στην παρούσα διδακτορική διατριβή, παρουσιάζονται τα αποτελέσματα από τις δομικές αναλύσεις και λειτουργικούς χαρακτηρισμούς των τελεστών του εκκριτικού συστήματος τύπου-ΙΙΙ (type III secretion system – T3SS), XopP και RipE1 των παθογόνων Xanthomonas campestris pv. campestris και Ralstonia solanacearum αντίστοιχα, ως προς την επίδραση τους στην υπομονάδα Exo70B1 του συμπλόκου εξωκύττωσης του φυτού ξενιστή Arabidopsis thaliana. Ο τελεστής XopP, όπως προκύπτει από τις in vivo και in vitro αναλύσεις, παρουσιάζει λειτουργία κινάσης, ενώ ο τελεστής RipE1, ο οποίος είχε προηγουμένως2χαρακτηρισθεί ως πρωτεάση κυστεΐνης, έχει την ικανότητα να διασπά την πρωτεΐνη Exo70B1 in vitro.Συνολικά, η παρούσα διατριβή συνδυάζει έναν αριθμό τεχνικών και μεθόδων από διάφορους τομείς της επιστήμης της βιολογίας (βιοπληροφορική, τεχνικές μοριακής βιολογίας, τεχνικές δομικής βιολογία, δοκιμασίες βιοφυσικής/βιοχημείας) και παρουσιάζει έναν πειραματικό σχεδιασμό για τον λειτουργικό χαρακτηρισμό πρωτεϊνικών μορίων.