Identification of molecules able to interfere with the interaction between Aurora-A and N-Myc in Neuroblastoma

Abstract

Neuroblastoma is a severe childhood disease accounting for the ~10% of all infant cancers. The MYCN gene amplification, coding for the N-Myc transcriptional factor, is an essential marker correlated with prognosis and progression. In these cells, another protein frequently implicated and overexpressed in cancer, the mitotic kinase Aurora-A, offers stabilization to N-Myc by binding directly to the highly conserved region called Myc Box I. As a result, the correct turnover of NMyc does not occur properly, explaining the elevated levels of this oncoprotein that is required for the growth of MYCN amplified cells. During the years, it has been demonstrated that certain competitive inhibitors of Aurora-A, like CD532 and Alisertib, previously designed to target the kinase activity of the protein, are also able to impair the formation of the undesired Aurora-A/N-Myc complex in Neuroblastoma. Indeed, due to essential conformational changes in the structure of the kinase caused by the binding of such inhibitors, it has been noticed in vitro and in vivo that N-Myc finds difficulty to associate at the complex.Here we present the identification of conformation disrupting compounds, starting from an in silico screening on the PDB among all the crystal structures of Aurora-A in complex with known inhibitors, where as a next step each one of them was superposed with that of the kinase bound to CD532 using the molecular modeling software PyMOL. Subsequently, the best candidates were initially tested with a kinase activity assay for their inhibitory ability against Aurora-A. Within a series of competition assays, conducted by Surface Plasmon Resonance means, we demonstrated for the first time in vitro that in presence of the previously identified compounds, N-Myc is not able to bind to Aurora-A. Last, through virtual screening and docking means, we obtained novel compounds to be tested for the exact same properties. Finally, we have identified promising compounds that could function as potential anti-cancer drugs that prevent the interaction between Aurora-A and N-Myc in Neuroblastoma.

Το νευροβλάστωμα είναι μια σοβαρή παιδική νόσος που ευθύνεται για το ~ 10% όλων των βρεφικών καρκίνων. Η ενίσχυση του γονιδίου MYCN, που κωδικοποιεί τον μεταγραφικό παράγοντα N-Myc, είναι ένας ουσιαστικός δείκτης που συσχετίζεται με την πρόγνωση και την εξέλιξη. Σε αυτά τα κύτταρα, μια άλλη πρωτεΐνη που εμπλέκεται συχνά και υπερεκφράζεται στον καρκίνο, η μιτωτική κινάση Aurora-A, προσφέρει σταθεροποίηση στο N-Myc με δέσμευση απευθείας στην εξαιρετικά διατηρημένη περιοχή που ονομάζεται Myc Box I. Ως αποτέλεσμα, ο σωστή αποδόμηση του N-Myc δεν γίνεται σωστά, εξηγώντας τα αυξημένα επίπεδα αυτής της ογκοπρωτεΐνης που απαιτούνται για την ανάπτυξη κυττάρων ενισχυμένων με MYCN κυτταρικών σειρών. Κατά τη διάρκεια των ετών, έχει αποδειχθεί ότι ορισμένοι ανταγωνιστικοί αναστολείς της Aurora-A, όπως το CD532 και το Alisertib, που προηγουμένως είχαν σχεδιαστεί για να στοχεύουν τη δραστηριότητα κινάσης της πρωτεΐνης, είναι επίσης ικανά να βλάψουν τον σχηματισμό του ανεπιθύμητου συμπλέγματος Aurora-A/N-Myc στο νευροβλάστωμα. Πράγματι, λόγω ουσιαστικών διαμορφωτικών αλλαγών στη δομή της κινάσης που προκαλούνται από τη δέσμευση αυτών των αναστολέων, έχει παρατηρηθεί in vitro και in vivo ότι το N-Myc δυσκολεύεται να συμμετέχει στο σύμπλοκο. Εδώ παρουσιάζουμε την αναγνώριση των ενώσεων που διαταράσσουν τη διαμόρφωση, ξεκινώντας από μία in silico διαλογή στην PDB μεταξύ όλων των κρυσταλλικών δομών της Aurora-A σε σύμπλοκο με γνωστούς αναστολείς, όπου ως επόμενο βήμα καθένας από αυτούς υπερτέθηκε με εκείνο της κινάσης που είναι δεσμευμένη με το CD532 χρησιμοποιώντας το λογισμικό μοριακής μοντελοποίησης PyMOL. Στη συνέχεια, οι καλύτεροι υποψήφιοι αρχικά δοκιμάστηκαν με μια δοκιμασία δραστικότητας κινάσης για την ανασταλτική τους ικανότητα έναντι της Aurora-A. Μέσα από μία σειρά από δοκιμασίες ανταγωνισμού, που πραγματοποιήθηκαν με μέσα Surface Plasmon Resonance, δείξαμε για πρώτη φορά in vitro ότι παρουσία των προηγουμένως αναγνωρισμένων ενώσεων, το N-Myc δεν είναι ικανό να δεσμευτεί με την Aurora-A. Τελευταία, μέσω virtual screening και docking, αποκτήσαμε καινοφανείς ενώσεις για να ελεγχθούν για τις ίδιες ακριβώς ιδιότητες. Τέλος, εντοπίσαμε πολλές υποσχόμενες ενώσεις που θα μπορούσαν να λειτουργήσουν ως πιθανά αντικαρκινικά φάρμακα που εμποδίζουν την αλληλεπίδραση μεταξύAurora-A και N-Myc στο νευροβλάστωμα.