Unraveling the role of endothelium Talin in angiogenesis

Abstract

Angiogenesis is a vital process in which new blood vessels develop from pre-existing ones and a rate limiting event in tumour growth and metastasis. The endothelium that lines the interior of blood vessels is constantly exposed to mechanical stimuli exerted from the blood flow and the surrounding extracellular matrix (ECM). Endothelial cells (ECs) sense and transmit these mechanical forces through a process known as mechanotransduction regulating downstream signalling pathways. In pathological situations such as cancer, ECs exert higher mechanical forces due to the elevated ECM stiffness formed during tumour progression. How endothelial cells respond to this deregulated mechanically environment in order to change their shape, proliferate and migrate to form new sprouts is poorly understood.The physical attachment of cells to ECM is achieved through a protein network called adhesome that is formed around integrin receptors and directly links the ECM to the cell cytoskeleton. As a consequence, adhesome proteins act as a key force sensing and transducing cellular element. Talin is a central member of the adhesome and participates in the transmission of mechanical forces between ECM and cell cytoskeleton. Although we know quite enough about the role of Talin in mechanical responses of cells at initial stages of cell adhesion very little is known about how Talin mediates mechanical responses in well- spread cells with established adhesions in tissues in vivo.Given the fact that Talin is indispensable for embryonic angiogenesis1 and vascular homeostasis 12 we aimed to study the impact of Talin deletion in mechanically equilibratedECs in established tumours. We utilized genetically modified mouse models that delete Talin1 specifically on endothelial cells in a time - controlled manner, various ex vivo and in vitro cellular/molecular assays, advanced live imaging techniques and cancer models.We found that the genetic ablation of Talin from ECs prevents tumour formation at initial stages of oncogenesis, impairs tumour growth at later stages and causes tumour regression of already established tumours. Detailed morphological analysis of tumour vasculature showed abnormal blood vessel structures that led to a dysfunctional and highly leaky vascular network. Likewise, we show that endothelial Talin is indispensable not only during the initial steps but also for the progression of lung metastasis. Our ex vivo and in vitro assays demonstrated that deletion of endothelial Talin decreases angiogenic sprouting and affects 2D/3D cell dynamics, migration and invasion. Moreover, we found that Talin elimination from well-spread ECs affected EC mechanoresponses, adhesion and cell morphology. Ectopic expression of either Talin-Head or Talin-Rod to substitute for the endogenous lack of Talin function in ECs results are sufficient to maintain mechanical stability of endothelial cells.Overall, our findings identify Talin1 as a critical regulator of vessel integrity and function during cancer development and highlight a novel essential role for Talin Head in mechanical responses of endothelial cells.

Η αγγειογένεση είναι μια ζωτικής σημασίας διαδικασία κατά την οποία αναπτύσσονται νέα αιμοφόρα αγγεία από το ήδη προϋπάρχον αγγειακό σύστημα των ιστών. Ειδικότερα, η καρκινική αγγειογένεση αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση για την ανάπτυξη των καρκινικών όγκων και των μεταστάσεων. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία βρίσκονται στο εσωτερικό των αιμοφόρων αγγείων, εκτίθενται συνεχώς σε μηχανικά ερεθίσματα προερχόμενα τόσο από τη συνεχή ροή του αίματος όσο και από την περιβάλλουσα εξωκυττάρια ύλη. Για να μπορέσουν ν’ ανταπεξέλθουν σε αυτό το μηχανικά-απαιτητικό περιβάλλον τα ενδοθηλιακά κύτταρα μετατρέπουν τα μηχανικά ερεθίσματα που δέχονται σε κυτταρικές βιοχημικές διεργασίες. Σε παθολογικές καταστάσεις όπως ο καρκίνος, τα ενδοθηλιακά κύτταρα δέχονται υψηλότερες μηχανικές πιέσεις σε σχέση με τις φυσιολογικές συνθήκες εξαιτίας της αυξημένης εναπόθεσης εξωκυττάριας ύλης που λαμβάνει χώρα κατά την εξέλιξη του όγκου. Ο τρόπος με τον οποίο τα ενδοθηλιακά κύτταρα ανταποκρίνονται σε αυτό το απορυθμισμένο μηχανικά- περιβάλλον προκειμένου να προσαρμόσουν το σχήμα τους, να πολλαπλασιαστούν και να μεταναστεύσουν για να σχηματίσουν νέα αγγεία είναι ελάχιστα κατανοητός.Η φυσική προσκόλληση των κυττάρων στην εξωκυττάρια ύλη επιτυγχάνεται μέσω ενός πρωτεϊνικού δικτύου που ονομάζεται συνδεόσωμα και σχηματίζεται γύρω από τους υποδοχείς ιντεγκρίνης. Το συνδεόσωμα περιλαμβάνει εκτός από τους υποδοχείς ιντεγκρίνης, δομικές και σηματοδοτικές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη σύνδεση της εξωκυττάριας ύλης με τον κυτταροσκελετό. Συνεπώς, με την βοήθεια αυτών των πρωτεϊνών, γνωστές και ως πρωτεΐνες κυτταρικής προσκόλλησης, τα κύτταρα αλληλοεπιδρούν και ανταποκρίνονται σε μηχανικά ερεθίσματα προερχόμενα από την εξωκυττάρια ύλη 3. Η Ταλίνη είναι μια από τις κύριες πρωτεΐνες του συνδεοσώματος και συμμετέχει στη μετάδοση μηχανικών δυνάμεων μεταξύ της εξωκυττάριας ύλης και του κυτταροσκελετού. Αν και γνωρίζουμε αρκετά για το ρόλο της Ταλίνης στις μηχανικές αποκρίσεις των κυττάρων κατά τ’ αρχικά στάδια της κυτταρικής προσκόλλησης, πολύ λίγα είναι γνωστά για το πώς η Ταλίνη μεσολαβεί στις μηχανικές αποκρίσεις των καλά προσκολλημένων κυττάρων στους ιστούς in vivo. Γνωρίζοντας πως η Ταλίνη είναι απαραίτητη για την εμβρυϊκή αγγειογένεση και την αγγειακή ομοιόσταση, επικεντρωθήκαμε στη μελέτη της επίδρασης της απαλοιφής της Ταλίνης σε μηχανικά εξισορροπημένα ενδοθηλιακά κύτταρα ειδικότερα σε ήδη εγκατεστημένους όγκους. Χρησιμοποιήσαμε γενετικά τροποποιημένα μοντέλα ποντικών, στα οποία επιτυγχάνεται η αποσιώπηση του γονιδίου της Ταλίνης ιστοειδικά (σε ενδοθηλιακά κύτταρα), και χρονοειδικά, διάφορες ex vivo και in vitro κυτταρικές/μοριακές δοκιμασίες, προηγμένες τεχνικές ζωντανής απεικόνισης και μοντέλα όγκων.Τ’ αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η γενετική αποσιώπηση του γονιδίου της Ταλίνης από τα ενδοθηλιακά κύτταρα παρεμποδίζει την ανάπτυξη του όγκου τόσο στα αρχικά όσο και στα μετέπειτα στάδια εμφάνισής του. Επιπρόσθετα, η ιστοειδική απαλοιφή της Ταλίνης σε ήδη ανεπτυγμένους όγκους, μειώνει το μέγεθός τους, προκαλώντας τη συρρίκνωση τους. 8|Page Λεπτομερής μορφολογική ανάλυση των αγγείων του όγκου κατέδειξε μη φυσιολογικές δομές αιμοφόρων αγγείων που οδήγησαν σε ένα δυσλειτουργικό και εξαιρετικά διαρρέων αγγειακό δίκτυο. Επιπλέον, δείξαμε ότι η ενδοθηλιακή Ταλίνη είναι απαραίτητη όχι μόνο κατά τα αρχικά στάδια της εξέλιξης των μεταστάσεων αλλά και κατά την αύξηση του μεγέθους τους. Οι ex vivo και in vitro δοκιμασίες, μας έδειξαν ότι η απουσία της Ταλίνης από τα ενδοθηλιακά κύτταρα μειώνει την αγγειογενετική εκβλάστηση και επηρεάζει τη δυναμική των κυττάρων και την ικανότητα μετανάστευσης τους σε περιβάλλοντα δύο και τριών διαστάσεων. Επιπρόσθετα, διαπιστώσαμε ότι η εξάλειψη της Ταλίνης από καλά προσκολλημένα ενδοθηλιακά κύτταρα επηρέασε τις μηχανικές αποκρίσεις αυτών, την προσκόλληση και τη μορφολογία τους. Η έκτοπη έκφραση των υποπεριοχών της Ταλίνης, είτε της κεφαλής (Talin-Head) είτε της ουράς (Talin-Rod) ήταν αρκετή για να αντικαταστήσει την ενδογενή έλλειψη της Ταλίνης και να διατηρήσει τη μηχανική σταθερότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων. Συνολικά, τα ευρήματά μας προσδιορίζουν την Tαλίνη ως κρίσιμο ρυθμιστή της ακεραιότητας και της λειτουργίας των αγγείων κατά την ανάπτυξη του καρκίνου και υπογραμμίζουν έναν νέο ουσιαστικό ρόλο για την κεφαλή της Ταλίνης στις μηχανικές αποκρίσεις των ενδοθηλιακών κυττάρων.