The DnaB-τ interaction in Bacillus

Abstract

The E. coli DNA polymerase holoenzyme III (pol HE III) consists of three functionally dinstict sub-assemblies: the core polymerase, the processivity factor (β subunit) and the clamp-loader. The β ring tethers the polymerase on the DNA for highly processive synthesis. The clamp loader (γ,τ,δ,δ,’χ,ψ subunits) is essential for the loading of the β subunit onto primed DNA. The τ subunit acts also as a central organiser at the replication fork by coupling the two core polymerases on the leading and lagging strand and the primosome to the replisome via a direct interaction with the helicase. The τ subunit mediates the helicase activity of the replicative helicase DnaB and consequently, regulates the rate of replisome progression. Therefore, the DnaB-τ interaction is crucial for the organisation and fast progression of the DNA replication fork.In order to investigate the helicase-τ interaction further and understand better the replication system in gram-positive bacteria, the Bacillus subtilis dnaX gene was cloned and the τ protein was purified. Limited proteolysis studies suggest that it has a domain organisation similar to its E. coli counterpart. Functional anlaysis reveal that it exhibits ATPase activity but, unlike that of E. coli τ, is not stimulated in vitro by DNA. Analytical gel filtration and ultracentrifugation experiments revealed that τ forms a stable complex with Bacillus stearothermophillus DnaB and that one τ pentamer interacts with one DnaB hexamer. Yeast two hybrid and surface plasmon resonance experiments provided direct evidence that it is the C-terminal domain of τ that interacts with the helicase. Single amino acids of the C-terminal domain that might be directly involved in the DnaB-τ interaction were also identified. The interaction interface of DnaB was also localised in its C-terminal. Functional studies showed that increasing amounts of τ inhibit the helicase activity of DnaB but not its ATPase activity. Atomic force microscopy studies revealed that τ adopts a crescent shape that resembles the E. coli clamp loader and images of the τ-helicase complex allowed us to propose a model for the wider architecture of the replisome including the replicative helicase. Finally, the single residue L381 was discovered to be critical for the integrity of the τ oligomer and its interaction with the helicase. This amino acid was mutated to an alanine and the properties of the corresponding mutant were investigated by gel filtration, circular dichroism, cross-linking studies and by genetic complementation experiments of the wt dnaX gene with the mutant L381A dnaX gene in vivo. Comparison of the properties between the L381A and the τ proteins revealed the importance of the L381 amino acid. In contrast, the proline at position 465, which was reported to be the position of an important thermosensitive mutation, is not involved in the oligomer formation of τ or the DnaB-τ interaction. Instead it might be critical for the τ-core polymerase interaction.

Η DNA πολυμεράση ΙΙΙ είναι απαραίτητη για την αντιγραφή του DNA στα βακτήρια. Το ολοένζυμο της DNA πολυμεράσης ΙΙΙ αποτελείται από τρία υποσύμπλοκα. Η κεντρική πολυμεράση έχει μία υπομονάδα με ενεργότητα πολυμεράσης 5′→3′ και μία υπομονάδα με ενεργότητα εξωνουκλεάσης 3′→5′. Ο ολισθαίνων συνδετήρας (β υπομονάδα) σχηματίζει έναν δακτύλιο γύρω από το DNA, προσδένοντας το υπόλοιπο ολοένζυμο της πολυμεράσης στο DNA. O φορτωτής του συνδετήρα (γ,τ,δ,δ,’χ,ψ υπομονάδες ) τοποθετεί τον ολισθαίνοντα συνδετήρα γύρω από το DNA. Στην διχάλα αντιγραφής ο μηχανισμός της καταλύει τη συντονισμένη σύνθεση DNA στον προπορευόμενο και στον καθυστερημένο κλώνο. Η υπομονάδα τ δρα επίσης ως κεντρικός οργανωτής στη διχάλα αντιγραφής συνδέοντας τις δύο πολυμεράσες του πυρήνα στον προπορευόμενο και τον καθυστερούμενο κλώνο και το πριμόσωμα με το ρεπλισώμα μέσω μιας άμεσης αλληλεπίδρασης με την ελικάση. Η υπομονάδα τ μεσολαβεί στη δραστηριότητα της ελικάσης DnaB και κατά συνέπεια, ρυθμίζει το ρυθμό της προόδου του ρεπλισώματος. Επομένως, η αλληλεπίδραση DnaB-τ είναι ζωτικής σημασίας για την οργάνωση και την ταχεία εξέλιξη της διχάλας αντιγραφής του DNA.Προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω η αλληλεπίδραση ελικάσης-τ και να κατανοηθεί καλύτερα το σύστημα αντιγραφής σε θετικά κατά Gram βακτήρια, το γονίδιο Bacillus subtilis dnaX κλωνοποιήθηκε και η πρωτεΐνη τ καθαρίστηκε. Μελέτες πρωτεόλυσης υποδεικνύουν ότι έχει δομική οργάνωση παρόμοια με την αντίστοιχη του E. coli. Η λειτουργική ανάλυση του ενζύμου αποκαλύπτει ότι παρουσιάζει δράση ATPάσης αλλά, σε αντίθεση με αυτή του E. coli τ, δεν ενεργοποιείται in vitro από το DNA.Πειράματα μοριακής διήθησης και υπερφυγοκέντρησης αποκάλυψαν ότι η τ υπομονάδα σχηματίζει ένα σταθερό σύμπλοκο με την Bacillus stearothermophillus DnaB και ότι ένα τ πενταμερές αλληλεπιδρά με ένα εξαμερές DnaB.Πειράματα με το σύστημα δύο υβριδίων στο ζυμομύκητα και τη τεχνική συντονισμού πλασμονίου επιφανείας παρείχαν άμεσες ενδείξεις ότι είναι η καρβοξυτελική περιοχή της τ υπομονάδας που αλληλεπιδρά με την ελικάση. Ταυτοποιήθηκαν επίσης μεμονωμένα αμινοξέα της C-καρβοξυτελικής περιοχής που μπορεί να εμπλέκονται άμεσα στην αλληλεπίδραση DnaB-τ. Η υπομονάδα αλληλεπίδρασης του DnaB εντοπίστηκε επίσης στο C-καρβοξυτελικό του άκρο. Λειτουργικές μελέτες έδειξαν ότι αυξανόμενες ποσότητες της τ αναστέλλουν τη δραστηριότητα της ελικάσης DnaB αλλά όχι τη δράση της ως ΑΤΡάση. Μελέτες με μικροσκοπία ατομικής δύναμης αποκάλυψαν ότι η τ πρωτεΐνη υιοθετεί ένα σχήμα ημισελήνου που μοιάζει με τον φορτωτή του E. coli και οι εικόνες του συμπλόκου τ-ελικάσης μας επέτρεψαν να προτείνουμε ένα μοντέλο για την ευρύτερη αρχιτεκτονική του ρεπλισώματος συμπεριλαμβανομένης της ελικάσης.Τέλος, το μεμονωμένο αμινοξύ L381 ανακαλύφθηκε ότι είναι κρίσιμο για την ακεραιότητα της τ πρωτεΐνης και για την αλληλεπίδρασή της με την ελικάση. Η μετάλλαξη αυτού του αμινοξέος σε αλανίνη και οι ιδιότητες της αντίστοιχης παραγόμενης πρωτεΐνης μελετήθηκαν με πειράματα μοριακής διήθησης, κυκλικού διχρωισμού, διασύνδεσης και τέλος με πειράματα γενετικής αντικατάστασης του γονιδίου wt dnaX με το μεταλλαγμένο γονίδιο L381A dnaX in vivo.Η σύγκριση των ιδιοτήτων μεταξύ των πρωτεϊνών με την μετάλλαξη L381A και την αγρίου τύπου αποκάλυψε τη σημασία του αμινοξέος L381. Αντίθετα, η προλίνη στη θέση 465, η οποία αναφέρθηκε ότι είναι σε θέση μιας σημαντικής θερμοευαίσθητης μετάλλαξης, δεν εμπλέκεται στον σχηματισμό ολιγομερών της τ ή στην αλληλεπίδραση DnaB-τ. Αντίθετα, μπορεί να είναι κρίσιμη για την αλληλεπίδραση της τ με την κεντρική πολυμεράση.