CMTM4 is a novel interactor of CXCR4 and regulator of CXCL12/CXCR4 signaling

Abstract

CXCR4 is a chemokine receptor that belongs to the superfamily of G protein-coupled receptors. The natural ligand of CXCR4 is the chemokine CXCL12. The interaction between the receptor and its ligand activates numerous signaling pathways, controlling cell migration, survival, proliferation and chemotaxis. The CXCL12/CXCR4 axis is essential in embryogenesis, hematopoiesis, in the regulation of the immune system and in tissue repair after wounding. Several pathological conditions are linked to deregulated CXCR4 signaling, such as WHIM syndrome, autoimmune diseases and cancer, where CXCR4 upregulation promotes tumor growth and metastasis. Although the central role of CXCR4 in physiology and disease has been extensively investigated during the last twenty-five years, efforts to develop pharmaceutical compounds targeting CXCR4 have up to date limited success. Thus, there is a great interest in the exploration of alternative ways to regulate the expression and signaling of CXCR4.In this study, we identified CMTM4, a member of the CKLF-like MARVEL Transmembrane domain containing protein family with relatively unknown function, as a novel interactor of CXCR4. CMTM4 has been mainly described as a tumor suppressor, and its expression is downregulated in many types of cancer by promoter methylation. We found that CMTM4, but not the closely related family member CMTM6, regulates the trafficking and protein stability of CXCR4 in transfected HEK 293T cells. To investigate how CMTM4 regulates CXCR4 signaling, we created a tetracycline-inducible CMTM4.F overexpression model in HeLa cells, a cervical cancer cell line that expresses endogenous CXCR4. We showed that CMTM4 co-immunoprecipitates and co-localizes with CXCR4 intracellularly and on the cell surface. Although CMTM4 does not affect the cell surface expression of CXCR4 or the ligand-independent endocytosis of the receptor, we found that it reduces the CXCL12-induced internalization of CXCR4. Additionally, we could show that CMTM4 expression reduces the activation of AKT in steady-state conditions and after ligand stimulation without affecting the activation of ERK1/2. The CXCL12-mediated chemotaxis and proliferation of CMTM4-expressing HeLa cells was also significantly attenuated while cell viability was not affected.Overall, our findings identified CMTM4 as a novel interactor of CXCR4 and regulator of CXCL12/CXCR4 signaling that could potentially serve as novel pharmacological approach to control CXCR4-mediated tumor growth and metastasis.

Ο CXCR4 είναι ένας υποδοχέας χημειοκινών που ανήκει στην υπεροικογένεια των υποδοχέων που συνδέονται με τις πρωτεΐνες G (G protein-coupled receptors). Ο φυσικός συνδέτης του CXCR4 είναι η χημειοκίνη CXCL12. Η αλληλεπίδραση μεταξύ του υποδοχέα και του συνδέτη του ενεργοποιεί πολυάριθμα σηματοδοτικά μονοπάτια, ελέγχοντας τη μετανάστευση, την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη χημειοταξία των κυττάρων. Ο άξονας CXCL12/CXCR4 είναι απαραίτητος για την εμβρυογένεση, την αιμοποίηση, τη ρύθμιση του ανοσοποιητικού συστήματος και την αποκατάσταση των ιστών μετά από τραυματισμό. Πολλές παθολογικές καταστάσεις σχετίζονται με την απορρύθμιση της σηματοδότησης του CXCR4, όπως το σύνδρομο WHIM, τα αυτοάνοσα νοσήματα και ο καρκίνος, όπου η αυξημένη έκφραση του CXCR4 προάγει την ανάπτυξη και τη μετάσταση του όγκου. Παρ ’ότι ο κεντρικός ρόλος του CXCR4 στη φυσιολογία και σε ασθένειες έχει διερευνηθεί εκτενώς κατά τη διάρκεια των τελευταίων είκοσι πέντε ετών, οι προσπάθειες για την ανάπτυξη φαρμακευτικών ουσιών που στοχεύουν τον CXCR4 έχουν μέχρι σήμερα περιορισμένη επιτυχία. Συνεπώς, υπάρχει μεγάλο ενδιαφέρον για την εξερεύνηση εναλλακτικών τρόπων ρύθμισης της έκφρασης και της σηματοδότησης του CXCR4. Στην παρούσα μελέτη, ταυτοποιήσαμε την πρωτεΐνη CMTM4, ένα μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών CKLF-like MARVEL Transmembrane domain containing με σχετικά άγνωστη λειτουργία, ως ένα νέο αλληλεπιδραστή του CXCR4. Η CMTM4 έχει περιγραφεί κυρίως ως ογκοκατασταλτικός παράγοντας και η έκφρασή της είναι μειωμένη σε πολλούς τύπους καρκίνου λόγω μεθυλίωσης του υποκινητή της. Διαπιστώσαμε ότι η CMTM4, αλλά όχι το συγγενικό μέλος της οικογένειας CMTM6, ρυθμίζει την ενδοκυττάρια μεταφορά και τη σταθερότητα της πρωτεΐνης CXCR4 σε μετασχηματισμένα κύτταρα HEK 293T. Για να διερευνήσουμε τον τρόπο με τον οποίο η CMTM4 ρυθμίζει τη σηματοδότηση του CXCR4, δημιουργήσαμε ένα μοντέλο υπερέκφρασης της CMTM4.F επαγόμενης από τετρακυκλίνη σε κύτταρα HeLa, μία κυτταρική σειρά καρκίνου του τραχήλου της μήτρας που εκφράζει ενδογενώς τον CXCR4. Δείξαμε ότι η CMTM4 συνανοσοκατακρημνίζεται και συνεντοπίζεται με τον CXCR4 ενδοκυττάρια και στην επιφάνεια των κυττάρων. Αν και η CMTM4 δεν επηρεάζει την έκφραση του CXCR4 στην επιφάνεια του κυττάρου ούτε την ανεξάρτητη από το συνδέτη ενδοκυττάρωση του υποδοχέα, διαπιστώσαμε ότι μειώνει την ενδοκυττάρωση του CXCR4 που προκαλείται από την CXCL12. Επιπλέον, δείξαμε ότι η έκφραση της CMTM4 μειώνει την ενεργοποίηση της AKT σε συνθήκες σταθερής κατάστασης και μετά από διέγερση με τον συνδέτη, χωρίς να επηρεάζει την ενεργοποίηση των ERK1/2. Η χημειοταξία και ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός που προκαλούνται από την CXCL12 μειώθηκαν επίσης σημαντικά σε κύτταρα HeLa που εκφράζουν την CMTM4, ενώ η κυτταρική βιωσιμότητα δεν επηρεάστηκε. Συνολικά, τα ευρήματά μας ταυτοποίησαν την CMTM4 ως ένα νέο αλληλεπιδραστή του CXCR4 και ρυθμιστή της CXCL12/CXCR4 σηματοδότησης, που θα μπορούσε ενδεχομένως να χρησιμεύσει σε μια νέα φαρμακολογική προσέγγιση για τον έλεγχο της ανάπτυξης και μετάστασης όγκων εξαρτώμενων από τον CXCR4.