Delineation the role of NLRP3 inflammasone in pathogenesis of severe asthma

Abstract

Background: Nucleotide oligomerization domain-like receptor 3 (NLRP3)-driven inflammatory responses by circulating and lung-resident monocytes are critical drivers of asthma pathogenesis. Autophagy restrains NLRP3-induced monocyte activation in asthma models. Yet, the effects of autophagy and its master regulator, transcription factor EB (TFEB), on monocyte responses in human asthma remain unexplored. Here, we investigated whether activation of autophagy and TFEB signaling suppress inflammatory monocyte responses in asthmatic individuals. Methods: Peripheral blood CD14+ monocytes from asthmatic patients (n = 83) and healthy controls (n = 46) were stimulated with LPS/ATP to induce NLRP3 activation with or without the autophagy inducer, rapamycin. ASC specks, caspase-1 activation, IL-1β and IL-18 levels, mitochondrial function, ROS release, and mTORC1 signaling were examined. Autophagy was eval-uated by LC3 puncta formation, p62/SQSTM1 degradation and TFEB activation. In a severe asthma (SA) model, we investigated the role of NLRP3 signaling using Nlrp3−/− mice and/or MCC950 administration, and the effects of TFEB activation using myeloid-specific TFEB-overexpressing mice or administration of the TFEB activator, trehalose. Results: We observed increased NLRP3 inflammasome activation, concomitant with impaired autophagy in circulating monocytes that correlated with asthma severity. SA patients also exhibited mitochondrial dysfunction and ROS accumulation. Autophagy failed to inhibit NLRP3-driven monocyte responses, due to defective TFEB activation and excessive mTORC1 signaling. NLRP3 blockade restrained inflammatory cytokine release and linked airway disease. TFEB activation restored impaired autophagy, attenuated NLRP3-driven pulmonary inflammation, and ameliorated SA phenotype. Conclusions: Our studies uncover a crucial role for TFEB-mediated reprogramming of monocyte inflamma-tory responses, raising the prospect that this pathway can be therapeutically harnessed for the management of SA.

Εισαγωγή: Οι φλεγμονώδεις αποκρίσεις που προέρχονται απο την ενεργοποίηση του NLRP3 στα μονοκύτταρα του αίματος και στα μονοκύτταρα του πνεύμονα εμπλέκονται στην παθογένεια του άσθματος. Η αυτοφαγία είναι βασικός ρυθμιστής των φλεγμονωδών αποκρίσεων και ειδικότερα, αποτελεί έναν από τους πιο σημαντικούς μηχανισμούς ρύθμισης του φλεγμονοσώματος NLRP3. Ωστόσο, οι επιδράσεις της αυτοφαγίας και του κύριου ρυθμιστή της, του μεταγραφικού παράγοντα ΕΒ (TFEB), στα μονοκύτταρα ασθενών με Σοβαρό άσθμα (ΣΑ) παραμένει άγνωστη. Στη παρούσα εργασία, διερευνήσαμε εάν η ενεργοποίηση της αυτοφαγίας και του μεταγραφικού παράγοντα TFEB μπορούν να καταστέλλουν τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις των μονοκυττάρων σε ασθενείς με άσθμα. Μέθοδοι: Απομονώσαμε CD14+ μονοκύτταρα από το περιφερικό αίμα ασθενών με άσθμα (ν=83) και υγιών δοτών (ν=46) και τα ενεργοποιήσαμε με λιποπολυσακχαρίτη και ΑΤΡ για να ενεργοποιήσουμε το φλεγμονόσωμα NLRP3 παρουσία ή όχι του επαγωγέα αυτοφαγίας, ραπαμυκίνη. Εξετάστηκαν ο σχηματισμός ASC speck, η ενεργοποίηση κασπάσης-1, τα επίπεδα IL-1β και IL-18, η μιτοχονδριακή λειτουργία, η απελευθέρωση ελευθέρων ριζών και η σηματοδότηση mTORC1. Η αυτοφαγία αξιολογήθηκε μετρώντας τον σχηματισμό LC3 puncta, με την αποικοδόμηση της πρωτεΐνης p62/SQSTM1 και την ενεργοποίηση του TFEB. Χρησιμοποιώντας ένα πειραματικό μοντέλο σοβαρού άσθματος, διερευνήσαμε τον ρόλο της σηματοδότησης του NLRP3 χρησιμοποιώντας Nlrp3−/− ποντίκια και/ή χορήγηση MCC950 και τον ρόλο της ενεργοποίησης TFEB χρησιμοποιώντας ποντίκια που υπερεκφράζουν TFEB στα κύτταρα μυελικής σειράς ή μέσω χορήγηση τρεαλόζης. Αποτελέσματα: Παρατηρήσαμε αυξημένη ενεργοποίηση του φλεγμονοσώματος NLRP3, με ταυτόχρονη μειωμένη αυτοφαγία στα μονοκύτταρα περιφερικού αίματος, αποτελέσματα τα αποία συσχετίστηκαν με παραμέτρους της σοβαρότητας του άσθματος. Οι ασθενείς με ΣΑ εμφάνισαν επίσης, μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και συσσώρευση ελευθέρων ριζών. Η αυτοφαγία απέτυχε να αναστείλει τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις των μονοκυττάρων που προέρχονται από το NLRP3, λόγω ελαττωματικής ενεργοποίησης του TFEB και της υπερβολικής σηματοδότησης mTORC1. Η καταστολή του NLRP3 φλεγμονοσώματος μείωσε την απελευθέρωση φλεγμονωδών κυρατοκινών και περιόρισε την φλεγμονή στους αεραγωγούς. Η ενεργοποίηση του TFEB αποκατέστησε την ελλατωματική αυτοφαγία, μείωσε την πνευμονική φλεγμονή και βελτίωσε τον φαινότυπο SA. Συμπεράσματα: Οι μελέτες μας αποκαλύπτουν οτι η ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα TFEB στα μονοκύτταρα ασθενών με ΣΑ είναι σημαντική, θέτοντας τον ως ένα νεό θεραπευτικό στόχο, για τη διαχείριση της ΣΑ.