Μελέτη φυτών της οικογένειας Lamiaceae ως προς την παραγωγή μεταβολιτών που αναστέλλουν τη δράση του υποδοχέα AhR, με εφαρμογή στις δερματικές παθήσεις

Abstract

The purpose of this thesis was to study the behavior of specific secondary metabolites, derived from plants of the Labiatae family, with respect to the aromatic hydrocarbon receptor (AhR).AhR activation by various environmental factors, especially microbial metabolites found in human skin, is involved in a number of inflammatory skin diseases such as seborrheic dermatitis (SD), but also in the development of skin cancer. Therefore, it would be very important to identify natural compounds that could inhibit AhR activation by microbial ligands such as 6-formylindole [3,2-b] carbazole (FICZ), indirubin (IND) and pityriazepine (PZ) or the original 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) ligand. Patient data have shown that topical application of a cream containing dry Rosmarinus officinalis L. leaf extract is effective in treating SD.Therefore, 5 extracts of Rosmarinus officinalis L., which differed from each other in terms of solvent or time of extraction, were prepared by a specific method. These extracts were first analyzed qualitatively and quantitatively by 1H-qNMR spectroscopy and then tested in vitro on guinea pig cytosol, human hepatoma cells (HG2L7.5c1) and human keratinocytes (SIK) regarding their behavior against the AhR, in the absence and presence of TCDD (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-para-dioxin) or of Malassezia-derived substances (FICZ, IND and PZ). The results showed that: Α.) all extracts of Rosmarinus officinalis L. investigated: i.) did not show agonistic action ii.) were able to antagonize the action of TCDD on AhR, with the methanolic extract (7-days of maceration) [ROS-7d] exhibiting the greatest activity iii.) the competition was competitive Β.) [ROS-7d] extract (10 μg/mL) in human keratinocytes antagonizes the activity of TCDD, FICZ, PZ and IND in AhR by 97,65%, 44,96%, 82,09% and 90,09% respectively.During the process, the main active ingredients of the methanolic extract [ROS-7d], namely carnosic acid (CA), carnosol (CS), 7-O-methyl-epi-rosmanol (7MER), 4',7-O-dimethylapigenine (DMA) and betulinic acid (BA) were isolated by innovative procedures. The metabolites were then tested for their ability to antagonize TCDD activity in AhR. The following experiment in vitro on guinea pig cytosol showed that CA, CS, BA, DMA and 7MER (100 μM each) reduced the activity of TCDD by 81,93%, 78,41%, 82,96%, 70,18% and 66,59% respectively. In the same experiment [ROS-7d] caused a decrease of 101,07%. The fact that has been found agents that act as competitors of AhR were found is very important because it can be used to prevent the toxicity of dioxins or to treat their established toxicity, as is the case of chloracne for example, in the prevention and treatment of various forms of skin cancer and inflammatory skin diseases.Τhe methanolic extracts of 61 plants grown in Greece of the Labiatae family from the following genera: Ballota, Hyssopus, Lavandula, Marrubium, Nepeta, Phlomis, Ocimum, Origanum, Rosmarinus, Salvia, Stachys, Coridothymus, Mentha, Melissa, Teiderium, Satureium, and Betonica, were analyzed quantitatively and qualitatively by 1H-qNMR spectroscopy, regarding the metabolites CA, CS, 7MER, BA, DMA, rosmanol (RO, was isolated from Rosmarinus officinalis L. and Salvia fruticosa Mill.) and 12-O-methylcarnosic acid (12MCA, was isolated from Rosmarinus officinalis L. and Salvia microphylla kunth), on the grounds that same another plant might be a better source for one or more or even all of the above substances. The dried leaves of each herb were used as a drug.The results showed that at least one of the test compounds was detected in 23 species (Rosmarinus (2), Salvia (14), Melissa, Ocimum, Mentha (2) Lavandula (3)). 7MER and RO were not identified in any extracts, while CA, CS and 12MCA were all detected simultaneously in species of the genera Salvia (7) and Rosmarinus (2). The highest amount of CA was found in Salvia somalensis Vatke (32,15±0,93 mg/g of dried drug)> Salvia pomifera subsp. pomifera (21,64±0,6 mg/g d.d)> Salvia fruticosa Mill. (12,50±1,56 mg/g d.d)> Salvia officinalis L. (11,66±4,33 mg/g d.d), of CS in Salvia somalensis Vatke (4,24±0,04 mg/g d.d)> Salvia fruticosa Mill. (1,57±0,38 mg/g d.d)> Salvia officinalis L. (1,11±0,43 mg/g d.d)> Salvia canariensis L. (1,13±0,32 mg/g d.d), of 12MCA in Salvia microphylla Kunth (10,68±3,27 mg/g d.d)> Salvia officinalis L. (6,12±2,3 mg/g d.d)> Salvia fruticosa Mill. (3,05±0,29 mg/g d.d)> Rosmarinus officinalis L. (2,03±0,66 a.d.), of DMA in Rosmarinus officinalis L. (0,41±0,1 mg/g d.d.)> Salvia viscosa Jacq. (0,33±0,05 mg/g d.d)> Rosmarinus officinalis var. prostratus Pasq. (0,12±0,02 mg/g d.d.), of BA in Rosmarinus officinalis L. (7,55±1,06 mg/g d.d.)> Rosmarinus officinalis var. prostratus Pasq. (3,88±0,04 mg/g d.d.). The genera Salvia and Rosmarinus were the best sources for CA, CS and 12MCA. Moreover, it was shown that the 1H-qNMR spectroscopy provides a useful tool for the quantitative and qualitative analysis of test compounds in complex extracts, in a simple, fast and direct way without any alteration of the sample.In order to give a more practical dimension to the whole issue, a series of experiments were designed regarding infusions, decoctions, turbolent-extractions, extracts in olive oil, medicinal tinctures and extracts in wine which concerned the plants that had the highest content of these metabolites but also possessed the widest recognition-dissemination worldwide. The Salvia fruticosa Mill., Salvia officinalis L. and Rosmarinus officinalis L. were therefore selected. The aim was to discover which formulation is the most suitable for a particular plant, for example whether it is more efficient to use it as a decoction or as an infusion; or for how long the drug should stay in contact with the solvent; or what is the optimal drug/solvent ratio is? also, in which case one or the other metabolite is dominant substance one or the other metabolite (which is also very important), thus giving for the first time answers with mathematical precision to basic and chronic questions concerning the investigated formulation. According to results, for the 3 plants examined the method of decoction was more efficient than the infusion and that extraction with turbulent flow was almost equal to decoction. It was also found that the tincture is not a suitable formulation for the abietanic diterpenes due to the instability of these substances in hydroalcoholic solvent, 45o and 70o. In addition, the olive oil extract of Rosmarinus officinalis L. was investigated and showed that the metabolites CA, CS, 12MCA, BA and DMA dissolve in the extra virgin olive oil and remain stable in this medium, which is particularly important for abietanic diterpenes. In the wine extract of Rosmarinus officinalis L., prepared by the method introduced by Dioscorides, rosmarinic acid (RA) was identified (standard RA has been isolated from Rosmarinus officinalis L.). Finally, examples of quantitative correlation were given between the formulations investigated. All samples were analyzed by 1H-qNMR.

Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να μελετηθεί η δραστικότητα συγκεκριμένων δευτερογενών μεταβολιτών, που προέρχονται από φυτά της οικογένειας των Χειλανθών, ως προς τον υποδοχέα των αρυλοϋδρογονανθράκων (AhR).Η ενεργοποίηση του (AhR) από διάφορους περιβαλλοντικούς παράγοντες, ιδιαίτερα δε από μικροβιακούς μεταβολίτες που βρίσκονται στο ανθρώπινο δέρμα, εμπλέκεται σε μια σειρά φλεγμονωδών δερματοπαθειών, όπως η σμηγματορροϊκή δερματίτιδα (SD), αλλά και στην ανάπτυξη καρκίνου του δέρματος. Ως εκ τούτου, θα ήταν πολύ σημαντικό να εντοπιστούν φυσικές ενώσεις που θα μπορούσαν να αναστείλουν την ενεργοποίηση του AhR από προσδέματα μικροβιακής προέλευσης όπως η 6-φορμυλινδολο[3,2-b]καρβαζόλη (FICZ), η ιντιρουμπίνη (IND) και η πιτυριαζεπίνη (PZ) ή από το πρωτότυπο πρόσδεμα 2,3,7,8-τετραχλωροδιβενζο-ρ-διοξίνη (TCDD). Δεδομένα από ασθενείς έδειξαν ότι η τοπική εφαρμογή κρέμας που περιέχει ξηρό εκχύλισμα φύλλων Rosmarinus officinalis L. είναι αποτελεσματική στην αντιμετώπιση της SD.Συνεπώς παρασκευάστηκαν με συγκεκριμένη μέθοδο 5 εκχυλίσματα Rosmarinus officinalis L. που διέφεραν μεταξύ τους ως προς το διαλύτη ή το χρόνο εμβροχής. Τα εν λόγω εκχυλίσματα αναλύθηκαν ποιοτικά και ποσοτικά με την μέθοδο της φασματοσκοπίας 1H-NMR και ύστερα ελέγχθηκαν in vitro, σε κύτταρα ινδικού χοιριδίου, σε κύτταρα ανθρώπινου ηπατώματος (HG2L7.5c1) και σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα (SIK 28), ως προς την συμπεριφορά τους έναντι του AhR, απουσίας και παρουσίας της TCDD (2,3,7,8-τετραχλωροδιβενζο-παρα-διοξίνη) ή των παραγόμενων ουσιών από την Malassezia (FICZ, IND, PZ). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι: Α.) όλα τα εκχυλίσματα του Rosmarinus officinalis L. που ερευνήθηκαν: i.) δεν εμφάνισαν αγωνιστική δράση ii.) ήταν σε θέση να ανταγωνίζονται τη δράση της TCDD στον AhR, με το μεθανολικό εκχύλισμα των 7 ημερών εμβροχής [ROS-7d] να εμφανίζει την μεγαλύτερη δραστικότητα iii.) ο ανταγωνισμός ήταν συναγωνιστικού τύπου Β.) το εκχύλισμα [ROS-7d] (10 μg/mL) έδειξε in vitro σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα ότι ανταγωνίζεται την δράση των TCDD, FICZ, PZ και IND στον AhR κατά 97,65%, 44,96%, 82,09% και 90,09% αντίστοιχα. Στην πορεία λήφθηκαν σε καθαρή μορφή τα βασικά δραστικά συστατικά του μεθανολικού εκχυλίσματος [ROS-7d], ήτοι το καρνοσικό οξύ (CA), η καρνοσόλη (CS), η 7-Ο-μεθυλ-epi-ροσμανόλη (7MER), η 4’,7-O-διμεθυλαπιγενίνη (DΜA) και το μπετουλινικό οξύ (BA). Κατόπιν οι απομονωμένες ουσίες ελέγχθηκαν αν είναι σε θέση να ανταγωνίζονται τη δράση της TCDD στον AhR. Το πείραμα που ακολούθησε έδειξε ότι οι μεταβολίτες CA, CS, BA, DMA και 7MER (100 μM έκαστο), μείωσαν τη δράση της TCDD κατά 81,93%, 78,41%, 82,96%, 70,18% και 66,59% αντίστοιχα. Στο ίδιο πείραμα το [ROS-7d] προκάλεσε μείωση της τάξης του 101,07%. Το ότι βρέθηκαν παράγοντες που συμπεριφέρονται ως ανταγωνιστές του AhR είναι κάτι πολύ σημαντικό γιατί μπορεί να βρει εφαρμογή στην πρόληψη της τοξικότητας των διοξινών ή στην αντιμετώπιση της εγκατεστημένης τοξικότητας τους, όπως για π.χ. συμβαίνει στην περίπτωση της χλωρακμής, στην πρόληψη-θεραπεία διάφορων μορφών του καρκίνου του δέρματος και των φλεγμονωδών δερματοπαθειών. Κατόπιν ερευνήθηκαν ποσοτικά και ποιοτικά με τη μέθοδο της φασματοσκοπίας 1H-qNMR, ως προς τους μεταβολίτες CA, CS, 7MER, BA, DΜA, ροσμανόλη (RO, απομονωμένη από Rosmarinus officinalis L. και Salvia fruticosa Mill.) και 12-Ο-μεθυλοκαρνοσικό οξύ (12MCA, απομονωμένο από Rosmarinus officinalis L. και Salvia microphylla Kunth) τα μεθανολικά εκχυλίσματα 61 φυτών που φύονται-καλλιεργούνται στην Ελλάδα της οικογένειας των Χειλανθών από τα ακόλουθα γένη: Ballota, Hyssopus, Lavandula, Μarrubium, Nepeta, Phlomis, Ocimum, Origanum, Rosmarinus, Salvia, Stachys, Coridothymus, Mentha, Melissa, Sideritis, Satureja, Teucrium, Lamium και Betonica, με το σκεπτικό μήπως κάποιο άλλο φυτό αποτελεί καλύτερη πηγή για μία ή για μερικές ή για όλες τις προαναφερόμενες ουσίες. Ως δρόγη χρησιμοποιήθηκαν τα αποξηραμένα φύλλα του εκάστοτε βοτάνου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τουλάχιστον μία από τις εξεταζόμενες ενώσεις ανιχνεύθηκε σε 23 είδη (Rosmarinus (2), Salvia (14), Melissa, Ocimum, Mentha (2) Lavandula (3)). Η 7MER και η RO δεν ταυτοποιήθηκε σε κανένα εκχύλισμα, ενώ το CA, η CS και το 12MCA, ανιχνεύθηκαν όλα μαζί ταυτοχρόνως μόνο σε είδη των γενών Salvia (7) και Rosmarinus (2). Η μεγαλύτερη ποσότητα CA βρέθηκε στη Salvia somalensis Vatke (32,15±0,93 mg/g αποξηραμένης δρόγης)> Salvia pomifera subsp. pomifera L. (21,64±0,6 mg/g α.δ)> Salvia fruticosa Mill. (12,5±1,56 mg/g α.δ)> Salvia officinalis L. (11,66±4,33 mg/g α.δ), της CS στη Salvia somalensis Vatke (4,24±0,04 mg/g α.δ)> Salvia fruticosa Mill. (1,57±0,38 mg/g α.δ)> Salvia officinalis L. (1,11±0,43 mg/g α.δ)> Salvia canariensis L. (1,13±0,32 mg/g α.δ), του 12MCA στη Salvia microphylla Kunth (10,68±3,27 mg/g α.δ)> S. officinalis (6,12±2,3 mg/g α.δ)> Salvia fruticosa Mill. (3,05±0,29 mg/g α.δ)> Rosmarinus officinalis L.(2,03±0,66 α.δ), της DMA στο Rosmarinus officinalis L. (0,41±0,1 mg/g α.δ)> Salvia viscosa Jacq. (0,33±0,05 mg/g α.δ)> Rosmarinus officinalis var. prostratus Pasq. (0,12±0,02 mg/g α.δ), του ΒΑ στο Rosmarinus officinalis L. (7,55±1,06 mg/g α.δ)> Rosmarinus officinalis var. prostratus Pasq. (3,88±0,04 mg/g α.δ). Τα γένη Salvia και Rosmarinus ήταν οι καλύτερες πηγές για το CA, την CS και το 12MCA. Διαπιστώθηκε επίσης ότι η φασματοσκοπία 1H-qNMR προσφέρει ένα χρήσιμο εργαλείο για την ποσοτική και ποιοτική ανάλυση των εξεταζόμενων ενώσεων σε σύνθετα εκχυλίσματα, με απλό, γρήγορο και άμεσο τρόπο χωρίς την αλλοίωση του δείγματος. Θέλοντας να δώσουμε μια πιο πρακτική διάσταση στο όλο θέμα σχεδιάστηκε μια σειρά πειραμάτων με εγχύματα, αφεψήματα, εκχυλίσματα με τυρβώδη ροή, ελαιόλυτα, φαρμακευτικά βάμματα και οινόλυτα, που αφορούσαν τα φυτά που παρουσίαζαν την μεγαλύτερη περιεκτικότητα στους εν λόγω μεταβολίτες αλλά και που κατείχαν την πιο ευρεία αναγνωρισιμότητα-διάδοση παγκοσμίως. Επιλέχτηκαν λοιπόν η Salvia fruticosa Mill., η Salvia officinalis L. και το Rosmarinus officinalis L. Ο απώτερος σκοπός ήταν να ανακαλυφθεί πια φαρμακοτεχνική μορφή είναι η πιο κατάλληλη, πια μέθοδος παρασκευής είναι η καλύτερη όσον αφορά τις εξεταζόμενες ουσίες, (π.χ. για ένα συγκεκριμένο φυτό είναι αποδοτικότερο να το χρησιμοποιούμε ως αφέψημα ή ως έγχυμα; ή για πόσο χρόνο πρέπει να μείνει σε επαφή η δρόγη με τον διαλύτη; ή πια είναι η βέλτιστη αναλογία δρόγης/διαλύτη; επίσης, σε ποια περίπτωση έχουμε κυρίαρχη ουσία τον ένα ή τον άλλο μεταβολίτη κάτι που είναι επίσης πολύ σημαντικό) δίνοντας με αυτό τον τρόπο για πρώτη φορά απαντήσεις με μαθηματική πλέον ακρίβεια σε βασικά και χρόνια ερωτήματα που αφορούν τις δρόγες που ερευνήθηκαν. Σύμφωνα με αποτελέσματα, για τα 3 εξεταζόμενα φυτά η μέθοδος της αφέψησης ήταν αποδοτικότερη από την έγχυση ενώ η εκχύλιση με τυρβώδη ροή εν θερμώ ήταν εφάμιλλη της αφέψησης. Επίσης διαπιστώθηκε ότι το φαρμακευτικό βάμμα δεν είναι κατάλληλη φαρμακευτική μορφή για τα διτερπένια αβιετανίου λόγω της αστάθειας που παρουσιάζουν οι ουσίες αυτές σε υδατοαλκοολικό διαλύτη 45 και 70 αλκοολικών βαθμών. Επιπλέον ερευνήθηκαν τα ελαιόλυτα του Rosmarinus officinalis L. στα οποία αποδείχθηκε ότι οι μεταβολίτες CA, CS, 12MCA, BA και DMA διαλύονται στο έξτρα παρθένο ελαιόλαδο και, ιδιαίτερα σημαντικό για τα διτερπένια αβιετανίου, παραμένουν σταθεροί στο μέσο αυτό. Στο οινόλυτο του Rosmarinus officinalis L., που παρασκευάστηκε με τη μέθοδο που εισήγαγε ο Διοσκουρίδης, ταυτοποιήθηκε το ροσμαρινικό οξύ (το οποίο απομονώθηκε από τα φύλλα του εν λόγω φυτού). Τέλος, δόθηκαν παραδείγματα ποσοτικής αντιστοιχίας μεταξύ των φαρμακευτικών μορφών που ερευνήθηκαν. Η ανάλυση όλων των δειγμάτων έγινε με 1H-qNMR.