Μελέτη του ρόλου του κυτταροστατικού παράγοντα Εmi2 στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου των ωοκυττάρων και των προεμφυτευτικών εμβρύων των θηλαστικών

Abstract

Mammalian oocytes enter meiosis before birth, where they remain arrested at G2/Prophase. Thus, oocytes may lie dormant in the ovary for many years (>40 in humans) until they receive the stimulus to grow and enter the first meiotic M-phase (MI). MI exit requires the proteolytic degradation of cyclin B1 through the action of the E3 ubiquitin ligase Anaphase Promoting Complex / Cyclosome (APC/C) and the subsequent inactivation of cyclin B1/Cdk1. Immediately after the first meiotic division, the oocyte enters the second meiotic M-phase and arrests at Metaphase II (MII) awaiting fertilization. MII arrest is maintained by the Cytostatic Factor activity (CSF) which inhibits the APC/C. CSF involves the Mos/MAPK pathway and the oocyte-specific APC/C inhibitor Emi2 (also known as Fbxo43). Emi2 is the final target of a cascade of events initiated by the oocyte-specific Mos kinase. Mos drives MAPK activation which leads to Emi2 phosphorylation and activation. At fertilization, the sperm introduces into the oocyte the phospholipase PLCζ which enables Emi2 degradation. Emi2 destruction releases the APC/C which then drives cyclin B1 degradation, leading to cyclin B1/Cdk1 inactivation followed by chromatid segregation and completion of meiosis. However, it is not known when Emi2 is first expressed and how it is regulated prior to MII arrest. Prior to MII, MI progression is regulated by the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). Both in MI and mitosis, the SAC operates physiologically to inhibit the APC/C so that anaphase onset is delayed until all chromosomes are under tension on the M-phase spindle. Misaligned chromosomes cause the activation of the checkpoint and the delay or inhibition of cell division. Our study aims to investigate whether Emi2 functions as a general surveillance factor that may arrest oocytes in M-phase when the spindle is damaged. In addition, we examine whether Emi2 possesses an M-phase-independent role, in regulating G2/Prophase arrest. Finally, we examine if Emi2 is expressed in cleavage embryos and whether Emi2 can prevent mitotic exit in somatic cells. Firstly, we tested whether arrest in MI due to spindle damage shows characteristics of CSF. To verify that MI arrest possesses CSF characteristics, we manipulated the activity of CSF regulators, such as SrCl2, MAPK and CaMKII. We find that inhibition of MAPK, alleviated spindle damage-induced arrest in MI. When we introduce a constitutively active form of CaMKII into Taxol-arrested MI oocytes, the oocytes are relived from the state of arrest. These results show that MI arrest in mouse oocytes is regulated in a CSF-like manner, similar to MII-arrested oocytes. The cytostatic factor Emi2 is the major regulator of CSF in MII-arrested vertebrate oocytes. Therefore, we examined whether Emi2 is responsible for establishing a CSF state of arrest in MI following a SAC-induced MI arrest. In the presence of nocodazole or taxol, mouse oocytes arrest in the first meiotic M phase. However, the SAC-induced robust MI arrest is disrupted when Emi2 is absent. The fragmentation phenotype, decondensed chromatin, and micronuclei/pronuclei formation observed in Emi2-depleted oocytes, were major indicators of cyclin B1/Cdk1 inactivation. In order to test if this phenotype is due to cyclin B1/Cdk1 inactivation we examined the state of APC/C activity by evaluating the expressionand degradation of M phase APC/C substrates such as Geminin and Securin. These experiments show that in the absence of Emi2, MI arrested oocytes lose their ability to contain APC/C activity at low levels, thus eventually allowing exit from the state of arrest. Then we proceeded to examine SAC activity in mouse oocytes arrested at MI. Based on our results, although the SAC is fully capable of launching the M phase checkpoint in MI, it is not sufficient to maintain MI arrest in the absence of Emi2. Emi2 is responsible for counterbalancing the weakening of the SAC and, thus, allows the maintenance of MI arrest. In the absence of Emi2, the gradual weakening of the SAC may lead to full APC/C activity and exit from MI.To establish further the ability of Emi2 to maintain MI arrest, we examined whether Emi2 is efficient in supporting a state of M-phase arrest in the absence of M-phase checkpoint inducing mechanisms. We overexpressed a GFP version of Emi2 into mouse oocytes and released them into M-phase. We found that Emi2 overexpression causes MI arrest in mouse oocytes while the chromosomes are properly aligned. The fact that overexpressed Emi2 is localized on spindle microtubules interacting with chromosomes is an indication that Emi2 may be primarily focused on silencing the APC/C at the spindle/chromosome area. We also found no evidence of SAC presence in Emi2-arrested oocytes. Thus, Emi2 alone is sufficient to cause MI arrest in mouse oocytes. Therefore, we examined whether Emi2-dependent MI arrest is subject to the same regulatory mechanisms as MII arrest. We find that inhibition of MAPK and inhibition of PP2A leads to degradation of Emi2. Inhibition of PP2A has a dramatic effect on Emi2 stability and inhibition of MAPK also drives Emi2-GFP degradation in MI, but at a slower pace. Therefore, as in CSF-induced MII arrest, MI oocyte activation leads to Emi2 degradation and subsequently exit from M phase arrest. Our results show that Emi2 is a major regulator of MI progression, by maintaining the M-phase checkpoint in response to spindle disruption.Premature menopause and exhaustion of the oocyte reserve can occur if oocytes exit G2/Prophase arrest spontaneously. We find that Emi2 possesses, an M-phase-independent role, in regulating G2/Prophase arrest. When Emi2 is depleted in mouse oocytes, the oocytes can spontaneously exit the state of arrest and enter MI. Furthermore, overexpression of Emi2 in mouse oocytes prohibits the physiological progression of oocytes into the first meiotic M-phase and oocytes remain arrested at G2/Prophase. Interestingly, we find that exogenous Emi2-GFP is localized in the nucleus of G2/Prophase oocytes. It is the first time that Emi2 shows a nuclear localization. Therefore, Emi2 is not only an M-phase exit regulator. Our results show that Emi2 regulates the nuclear APC/C activity to control G2/Prophase arrest and progression into M-phase. We then proceeded to establish whether Emi2 possesses a role in the cell cycle of somatic cells. First, we examined if Emi2 is expressed in mitotic 2-cell or 4-cell embryos. There was no evidence that Emi2 is expressed in these preimplantation embryo stages. Furthermore, we addressed whether Emi2 can prevent mitotic exit in somatic cells. Firstly, we successfully established FACS analysis protocols for monitoring cell cycle dynamics in somatic cells transfected with an Emi2-GFP plasmid. In HEK293 and HeLa cell lines, overexpression of Emi2 appears to lead to arrest in the G2/M phases of the cell cycle. Emi2 may act as a cytostatic factor in somatic cells, as exogenous introduction of Emi2 significantly slowed cell proliferation. Therefore, there is a significant delay as Emi2-expressing cells attempt to pass through G2/M phases of the cell cycle. Confocal imaging experiments imply that Emi2 expression leads to a delay or arrest at the G2 phase of the cell cycle.. The slower proliferation of cells expressing Emi2 may be due to a delayed passing through the G2 phase of the cell cycle. Our results in somatic cells show that Emi2 can act as a cytostatic factor in cycling cells since the exogenous introduction of Emi2 slows down significantly cell proliferation. These exciting results may prove to be beneficial for cancer treatment.

Τα ωοκύτταρα των θηλαστικών εισέρχονται στη μείωση πριν από τη γέννηση, όπου παραμένουν ακινητοποιημένα στη φάση G2/πρόφαση Ι του κυτταρικού κύκλου. Στην εφηβεία, η αύξηση της ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH) κατά τη διάρκεια του αναπαραγωγικού εμμηνορρυσιακού κύκλου προκαλεί την ενεργοποίηση του συμπλόκου κυκλίνης B1/Cdk1 και οδηγεί στην είσοδο στην πρώτη μειωτική φάση Μ (MI) (Adhikari et al., 2012; Chesnel & Eppig, 1995; J. Eppig, 1996). Η πρόωρη εμμηνόπαυση και η εξάντληση του αποθεματικού ωοκυττάρων μπορεί να συμβεί εάν τα ωοκύτταρα εγκαταλείψουν αυθόρμητα τη G2/πρόφαση. Οι μηχανισμοί που επάγουν την ακινητοποίηση αυτή είναι η αναστολή της δραστηριότητας της κυκλίνης Β1/Cdk1. Κατά τη διάρκεια της ακινητοποίησης, το σύμπλοκο κυκλίνη Β1/Cdk1 παραμένει σε χαμηλά επίπεδα λόγω της δράσης της λιγάσης APC/C. Tα ωοκύτταρα αφού εξέλθουν της ακινητοποίησης αυτής εισέρχονται στη ΜΙ. Όπως και στη μίτωση έτσι και στη μείωση, η έξοδος από τη MI απαιτεί την πρωτεολυτική αποικοδόμηση της σεκιουρίνης (Securin) και της κυκλίνης Β1 μέσω της δράσης λιγάσης APC/C και την επακόλουθη αδρανοποίηση του συμπλόκου κυκλίνης Β1/Cdk1 (Prinz, Hwang, Visintin, & Amon, 1998). Στη συνέχεια, το ωοκύτταρο εισέρχεται στη δεύτερη μειωτική φάση Μ και ακινητοποιείται στη μεταφάση II (MII) εν αναμονή της γονιμοποίησης (Masui, 2000). Η ακινητοποίηση στη μετάφαση ΙΙ της μείωσης συντηρείται από τη δραστηριότητα της κυτταροστατικής ενεργότητας CSF (Cytostatic Factor) που εμποδίζει τη δράση της λιγάσης APC/C (B. J. Tunquist & Maller, 2003). O CSF περιλαμβάνει το μονοπάτι Mos/MAPK και τον ωοκύτταρο-ειδικό αναστολέα της APC/C, Emi2 (Fbxo43) (Madgwick et al., 2006; Nishiyama et al., 2007). Ο Emi2 είναι ο τελικός στόχος μίας αλληλουχίας αντιδράσεων που έχουν ως αφετηρία την ωοκύτταρο-ειδική κινάση Mos. Ο παράγοντας Mos οδηγεί σε ενεργοποίηση την κινάση MAPK που φωσφορυλιώνει τον Emi2 και τον καθιστά διαθέσιμο στη PP2A φωσφατάση (Tung et al., 2005). Η επιτήρηση της ορθής πορείας της ΜΙ γίνεται από τον μηχανισμό ελέγχου της ατράκτου (Spindle Assembly Checkpoint ,SAC) . Και στη MI και στη μίτωση, ο ρόλος του SAC είναι να ενεργοποιεί το σημείο ελέγχου της φάσης Μ και συγκεκριμένα να εμποδίσει τη δράση της APC/C, έτσι ώστε να καθυστερήσει η ανάφαση έως ότου όλα τα χρωμοσώματα να είναι ευθυγραμμισμένα και συνδεδεμένα στους μικροσωληνίσκους της ατράκτου. Τα μη ευθυγραμμισμένα χρωμοσώματα προκαλούν την ενεργοποίηση του σημείου ελέγχου και την καθυστέρηση ή την παρεμπόδιση της κυτταροδιαίρεσης (Musacchio & Salmon, 2007; Yu, 2002). Στα μιτωτικά κύτταρα, η παρατεταμένη SAC-εξαρτώμενη διακοπή της φάσης Mοδηγεί σε μιτωτική καταστροφή, ένα γεγονός κατά το οποίο ένα κύτταρο καταστρέφεται κατά τη διάρκεια της μίτωσης. Δυσλειτουργία του SAC, τόσο στα μειωτικά όσο και στα σωματικά κύτταρα, οδηγεί σε μη σωστό διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων και τη δημιουργία ανευπλοειδών θυγατρικών κυττάρων (Musacchio & Salmon, 2007). Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να διερευνηθεί σε βάθος ο ρόλος και η λειτουργία του κυτταροστατικού παράγοντα Εmi2 κατά τη μείωση των ωoκυττάρων, κατά την προεμφυτευτική ανάπτυξη των εμβρύων του ποντικού και στη μίτωση των σωματικών κυττάρων. Αρχικά ελέγχθηκε αν η ακινητοποίηση στη φάση ΜΙ λόγω βλάβης της ατράκτου παρουσιάζει χαρακτηριστικά του CSF. Προκειμένου να εξεταστεί αυτό το ερώτημα προκλήθηκε μια εξαρτώμενη από τον SAC ακινητοποίηση στη φάση ΜΙ, επωάζοντας ωοκύτταρα ποντικού με ταξόλη ή νοκοδαζόλη. Στη συνέχεια, τα ωοκύτταρα που είχαν ακινητοποιηθεί στη ΜΙ με κάποιο από αυτούς τους φαρμακολογικούς παράγοντες υποβλήθηκαν σε επίδραση με SrCl2 (που ενεργοποιεί τις ταλαντώσεις Ca2+) και σε πειραματικές διαδικασίες που επηρεάζουν παράγοντες, όπως η MAPK και η CaMKII, που σχετίζονται με την ακινητοποίηση από τον CSF. Τα ωοκύτταρα κατάφεραν να εξέλθουν της ακινητοποίησης. Επομένως, η ακινητοποίηση στα ωοκύτταρα ποντικού φαίνεται ότι ρυθμίζεται από τον CSF, με τρόπο παρόμοιο με τα ωοκύτταρα που έχουν ακινητοποιηθεί στη ΜΙΙ. Γνωρίζοντας από τη βιβλιογραφία ότι ο κυτταροστατικός παράγοντας Emi2 είναι ο κύριος ρυθμιστής του CSF στα ωοκύτταρα των σπονδυλωτών που βρίσκονται ακινητοποιημένα στη φάση ΜII (Madgwick et al., 2006; Shoji et al., 2006), εξετάστηκε αν είναι υπεύθυνος και για την ρύθμιση των χαρακτηριστικών τύπου CSF κατά την ακινητοποίηση στη ΜΙ. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η ισχυρή ακινητοποίηση στη MI που προκαλείται από τον SAC παρουσία βλάβης στο σχηματισμό και στη δομή της ατράκτου, διακόπτεται όταν ο Emi2 απουσιάζει.Ο φαινότυπος κατακερματισμένων ωοκυττάρων, η αποσυμπυκνωμένη χρωματίνη και ο σχηματισμός μικροπυρήνων/προπυρήνων, που εντοπίστηκαν στα ωοκύτταρα που είχε αποσιωπηθεί ο Emi2 παρουσία ενεργοποιημένου SAC και εξέρχονταν της ακινητοποίησης στη ΜΙ αποτέλεσαν κύριες ενδείξεις απενεργοποίηση του συμπλόκου κυκλίνης Β1/Cdk1. Τα πειράματά μας, έδειξαν πως απουσία του Emi2, η απενεργοποίηση του συμπλόκου, παρουσία ταξόλης, συμβαίνει λόγω ενεργοποίησης της λιγάσης APC/C και πως και καταλήγει σε έξοδο από τη ΜΙ. Είναι γνωστό όπως αναφέραμε και παραπάνω πως ένα ισχυρό σημείο ελέγχου που εξαρτάται από το SAC ξεκινά ως απόκριση σε βλάβη της ατράκτου. Εντούτοις, θελήσαμε να δούμε αν η παρουσία του SAC επηρεάζεται κατά τη διάρκεια της ακινητοποίησης στη ΜΙ. Εντοπίσαμε ότι ο SAC φθίνει στην πορεία ακινητοποίησης στη ΜΙ. Επομένως, ο Emi2 είναι υπεύθυνος για την αντιστάθμιση της αποδυνάμωσης του SAC και επιτρέπει τη διατήρηση της ακινητοποίησης στη MI. Απουσία του Emi2, η σταδιακή αποδυνάμωση του SAC δεν επιτρέπει τη διατήρηση του σημείου ελέγχου, οδηγώντας σε πλήρη δραστηριότητα της APC/C και στην έξοδο από τη MI.Όταν ο Emi2 υπερεκφράστηκε σε ωοκύτταρα ποντικού αυτά παρέμειναν ακινητοποιημένα στη ΜΙ, η έκφρασή του εντοπίστηκε στην περιοχή της ατράκτου και διερευνήθηκε από ποιους παράγοντες επηρεάζεται αυτή η ακινητοποίηση. Διαπιστώθηκε πως ο Emi2 από μόνος του ήταν επαρκής για να προκαλέσει ακινητοποίηση στη MI στα ωοκύτταρα ποντικού και η εξαρτώμενη από τον Emi2 ακινητοποίηση στη φάση ΜΙ ρυθμίζεται από τους ίδιους μηχανισμούς που ρυθμίζουν και την ακινητοποίηση στη φάση ΜΙΙ.Στη συνέχεια, εξετάσαμε τον ρόλο του Emi2 στη G2/πρόφαση Ι. Στα ωοκύτταρα που βρίσκονταν ακινητοποιημένα στη G2/πρόφαση Ι φάνηκε πως η αποσιώπηση του Emi2 οδηγεί σε αυθόρμητη έξοδο των ωοκυττάρων από την ακινητοποίηση αυτή. Αντίθετά, η υπερέκφρασή του Emi2 οδηγεί σε καθυστέρηση της αυθόρμητης εξόδου από τη G2/πρόφαση Ι. Τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων, μας οδηγούν στο συμπέρασμα πως ο Emi2 είναι απαραίτητος για τη διατήρηση της κατάστασης ακινητοποίησης στη G2/πρόφαση Ι των ωοκυττάρων του ποντικού. Επίσης, ο πυρηνικός εντοπισμός του Emi2 σε αυτή την φάση του κυτταρικού κύκλου μας ωθεί στη διαπίστωση ότι η δράση του στην πρόφαση των ωοκυττάρων του ποντικού αφορά την πυρηνική αναστολής της APC/C.Στη συνέχεια, μελετήσαμε τον ρόλο του Emi2 σε μιτωτικά κύτταρα, όπως εμβρυικά κύτταρα στη φάση της αυλάκωσης και κυτταροκαλλιέργειες σωματικών κυττάρων. Τα αποτελέσματα στα εμβρυικά κύτταρα μας οδήγησαν στο συμπέρασμα πως ο Emi2 δεν εκφράζεται στο στάδιο των δύο ή τεσσάρων κυττάρων των εμβρύων ποντικού. Στις κυτταρικές σειρές HEK293 και HeLa, η υπερέκφραση του Emi2 δείχνει να οδηγεί σε ακινητοποίηση στη φάση G2 του κυτταρικού κύκλου στη μίτωση. Επιπλέον, ο Emi2, ενδεχομένως να δρα ως κυτταροστατικός παράγοντας στα σωματικά κύτταρα, καθώς η εξωγενής εισαγωγή του Emi2 επιβράδυνε σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό.Συνολικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης κατέδειξαν τη μεγάλη σημασία του κυτταροστατικόυ ρόλου του Emi2 για την επιτήρηση της πορείας της μείωσης Ι. Επιπλέον, από τα πειραματικά μας αποτελέσματα, διαπιστώνουμε ότι ο Emi2 μπορεί να επιδρά κυτταροστατικά και στα σωματικά κύτταρα. Αυτή η παρατήρηση, ενδεχομένως να επιτρέψει στο μέλλον τη φαρμακευτική χρήση του Emi2 για την καταστολή πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων, όπως είναι τα καρκινικά κύτταρα.