Βιοτεχνολογική αξιοποίηση λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας για την παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας

Abstract

In recent years the concept of biorefinery has been receiving a significant amount of interest in a commercial and academical basis in many parts of the world. The term biorefinery refers to an integrated and sustainable treatment within one or an entire network of industrial plants that converts residual forms of lignocellulosic biomass, such as forest and agricultural residues to high value-added products. The ultimate goal is to minimize waste while maximizing the value of biomass in order to produce a variety of chemicals, biomaterials, fuels, but also bioactive compounds in the food, chemical and cosmetics industries. As part of the biorefinery process, hybrid technologies from various fields are applied, including engineering, agriculture, chemistry and microbiology, in an integrated process of separation of biomass into its structural components, viz cellulose, hemicellulose and lignin, with the perspective of its fractionation. Among variant pretreatment methods, a mild oxidative pretreatment (OxiOrganosolv), namely pretreatment using organic solvents and oxygen, was selected and applied successfully, as the effectiveness of the method in terms of high degree of separation in structural components of lignocellulosic biomass was confirmed after mitigation with simultaneous low production of toxic inhibitors as degradation products of biomass sugars. The structural compounds can be further converted through processes involving enzymatic depolymerization and microbial fermentation into products of high interest. Such compounds are lactic acid, prebiotic xylo-oligosaccharides and omega-3 fatty acids, which were the prominent study of the present dissertation.Lactic acid, due to its numerous properties, is considered as a high value industrial product used as a precursor for the production of its polymers, such as polylactic acid, while it can be used in plenty of fields such as food industry, chemicals, medicine, fodder etc. The oligosaccharides from xylose found in the hemicellulose fraction can be isolated after hydrolysis of the xylan of lignocellulosic biomass, as they are compounds with prebiotic activity that have various beneficial effects on both human and animal health. The production of omega-3's polyunsaturated fatty acids by heterotrophic microalgae has aroused scientific interest due to their multiple health benefits, due to their high content of docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA). Microalgae are able to utilize glucose derived from lignocellulosic biomass as a carbon source to produce fatty acids achieving high yields. The purpose of this dissertation was the discovery and establishment of an integrated bioprocess by utilizing both forest and agricultural residues to produce products of high added value. In the first step, an innovative variant of the classic oxidative pretreatment (Organosolv) was applied, using a mixture of water with organic solvents and oxygen, named OxiOrganosolv. Various pretreatment conditions were tested, such as the type of organic solvent used, temperature, residence time and pressure exerted, in order to optimize the subsequent yields of enzymatic saccharification and microbial fermentation. The resulting solid pretreatment fraction was utilized and studied to produce enantiomerically pure D-lactic acid using the Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and omega-3 fatty acids from the heterotrophic microalga Crypthecodinium cohnii. Furthermore, the characteristics of prebiotic oligosaccharides from the aqueous phase of the liquid fraction after the removal of the organic solvents were studied and analyzed.This specific OxiOrganosolv pretreatment was applied for the first time to forest and agricultural biomass, achieving high yields in terms of its cellulose composition (maximum content 93 % w/w) with a correspondingly high degree of delignification (maximum yield 99%). After enzymatic hydrolysis, the effectiveness of the pretreatment was evaluated in terms of the concentration of glucose produced, the percentage conversion of cellulose to glucose, but also the total reducing sugars for all pretreated biomass samples. Then the solid fraction of forest biomass was exploited , for the first time, for the production of D-lactic acid as a source of sugars in a simultaneous saccharification and fermentation process (SSF), after optimization of the growth conditions and the production of lactic acid by the specific lactic acid bacterium. High yields of D-lactic acid (maximum: 62 g/L) were achieved with low enzyme loading (9,6 FPU/g substrate), while minimizing the interfering sugar degradation products. In addition, the liquid fraction of the OxiOrganosolv pretreatment derived from forest biomass was utilized and analyzed, having a high concentration of produced oligosaccharides (maximum yield: 98 mg/g of initial biomass), a higher percentage of acetylated substituents and a low percentage of inhibitors (10 mg/g biomass). Finally, for the first time, both the solid and liquid fractions of agricultural biomass were utilized for the production of ω-3 fatty acids from this specific microalga with a yield of 30% produced DHA (22:6, ω-3, product of interest) compared to 70% of total fatty acids (TFAs) produced. Additionally, the effect of "green catalysts" POMs combined with OxiOrganosolv pretreatment was evaluated for the first time on solid fraction samples of forest origin in cultures with this specific microalga for the production of ω-3 fatty acids, where high yields were achieved.

Τα τελευταία χρόνια η έννοια του βιοδιυλιστηρίου κερδίζει ολοένα και αυξανόμενη προσοχή σε εμπορικό και ακαδημαϊκό επίπεδο σε πολλά μέρη του κόσμου. Ως βιοδιυλιστηρίο ορίζεται μία ολοκληρωμένη και βιώσιμη επεξεργασία στα πλαίσια μιας ή ενός ολόκληρου δικτύου εγκαταστάσεων που μετατρέπουν τις υπολειμματικές μορφές της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας, όπως π.χ. τα δασικά και γεωργικά υπολείμματα σε προϊόντα υψηλής προστιθέμενης αξίας. Απώτερο στόχο αποτελεί η ελαχιστοποίηση των απορριμάτων με παράλληλη μεγιστοποίηση της αξίας της βιομάζας προς παραγωγή μιας ποικιλίας χημικών ουσιών, βιοϋλικών, καυσίμων, αλλά και βιολειτουργικών ενώσεων στη βιομηχανία των τροφίμων, των χημικών και των καλλυντικών. Στην ιδέα του βιοδιυλιστηρίου, εφαρμόζονται υβριδικές τεχνολογίες από διάφορους τομείς, συμπεριλαμβανομένης της μηχανικής, της γεωπονίας, της χημείας και της μικροβιολογίας, σε μία ενσωματωμένη διαδικασία διαχωρισμού της βιομάζας στα δομικά συστατικά της, δηλαδή της κυτταρίνης, ημικυτταρίνης και λιγνίνης, κατόπιν του σταδίου της προκατεργασίας για την επίτευξη της κλασματοποίησής της. Ανάμεσα σε διάφορες μεθόδους προκατεργασίας, επιλέχθηκε και εφαρμόστηκε επιτυχώς μία ήπια οξειδωτική οργανολυτική προκατεργασία (OxiOrganosolv), δηλαδή η προκατεργασία με χρήση μίγματος οργανικών διαλυτών με νερό μαζί με οξυγόνο, καθώς επιβεβαιώθηκε η αποτελεσματικότητα της μεθόδου λόγω του υψηλού βαθμού διαχωρισμού στα βασικά συστατικά της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας έπειτα από εξασφάλιση υψηλού ρυθμού απολιγνοποίησης με ταυτόχρονη χαμηλή παραγωγή τοξικών παρεμποδιστών ως προϊόντα αποικοδόμησης των σακχάρων της βιομάζας. Τα δομικά συστατικά μπορούν περαιτέρω να μετατραπούν μέσω διεργασιών που περιλαμβάνουν ενζυµικό αποπολυµερισµό και µικροβιακές ζυµώσεις σε προϊόντα υψηλού ενδιαφέροντος. Τέτοιες ενώσεις είναι το γαλακτικό οξύ, οι πρεβιοτικοί ξυλο-ολιγοσακχαρίτες και τα ω-3 λιπαρά οξέα που αποτέλεσαν και την κύρια μελέτη της παρούσας διδακτορικής διατριβής.Το γαλακτικό οξύ, λόγω μιας σειράς διαφορετικών ιδιοτήτων που παρουσιάζει, αποτελεί υψηλής αξίας βιομηχανικό προϊόν που χρησιμοποιείται ως πρόδρομη ένωση για την παραγωγή των πολυμερών του, όπως είναι το πολυγαλακτικό οξύ, ενώ μπορεί να αξιοποιηθεί σε διάφορους τομείς όπως στη βιομηχανία των τροφίμων, χημικών, της ιατρικής, ζωοτροφών κ.λ.π.. Οι ολιγοσακχαρίτες της ξυλόζης που συναντώνται στο κλάσμα της ημικυτταρίνης μπορούν να απομονωθούν ύστερα από υδρόλυση της ξυλάνης της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας, καθώς αποτελούν ενώσεις με πρεβιοτική δράση που συνεπάγονται ποικίλες ευεργετικές επιδράσεις στην υγεία των ανθρώπων και των ζώων. Η παραγωγή ω-3 πολυακόρεστων λιπαρών οξέων από ετερότροφα μικροφύκη έχει κεντρίσει το επιστημονικό ενδιαφέρον χάρη στα πολλαπλά οφέλη που προσφέρουν στην υγεία, εξαιτίας της υψηλής τους περιεκτικότητας σε εικοσιδυαεξανοϊκό οξύ (DHA) και εικοσαπεντανοϊκό οξύ (EPA). Τα μικροφύκη είναι ικανά να αξιοποιήσουν τη γλυκόζη που προέρχεται από τη λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα ως πηγή άνθρακα προς παραγωγή λιπαρών οξέων επιτυγχάνοντας υψηλές αποδόσεις.Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η ανακάλυψη και εγκαθίδρυση μίας ολοκληρωμένης βιοδιεργασίας αξιοποίησης δασικών και γεωργικών υπολειμμάτων προς παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Σε πρώτο στάδιο εφαρμόστηκε μία καινοτόμος παραλλαγή της κλασικής οργανολυτικής προκατεργασίας (Organosolv), με χρήση μίγματος νερού με οργανικούς διαλύτες και οξυγόνο, που ονομάστηκε OxiOrganosolv. Έγινε έλεγχος διάφορων συνθηκών προκατεργασίας, όπως ο τύπος του χρησιμοποιούμενου οργανικού διαλύτη, η θερμοκρασία, ο χρόνος παραμονής και η ασκούμενη πίεση, προκειμένου να βελτιστοποιηθούν οι τελικές αποδόσεις ενζυμικής σακχαροποίησης και μικροβιακών ζυμώσεων. Το προκύπτον στερεό κλάσμα της προκατεργασίας αξιοποιήθηκε και μελετήθηκε για την παραγωγή εναντιομερικά καθαρού D-γαλακτικού οξέος με τη βοήθεια του ομοζυμωτικού γαλακτοβακτηρίου Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus και ω-3 λιπαρών οξέων από το ετερότροφο μικροφύκος Crypthecodinium cohnii. Ακόµη, μελετήθηκαν και αναλύθηκαν τα χαρακτηριστικά των πρεβιοτικών ολιγοσακχαριτών από την υδατική φάση του υγρού κλάσµατος της προκατεργασίας μετά την απομάκρυνση των οργανικών διαλυτών.Η συγκεκριμένη προκατεργασία OxiOrganosolv εφαρμόστηκε για πρώτη φορά σε δασική και αγροτική βιομάζα, επιτυγχάνοντας υψηλές αποδόσεις ως προς την σύστασή της σε κυτταρίνη (μέγιστη περιεκτικότητα 93 % w/w) με αντίστοιχο υψηλό βαθμό απολιγνοποίησης (μέγιστη απόδοση 99%). Μετά από ενζυμική υδρόλυση αξιολογήθηκε η αποτελεσματικότητα της προκατεργασία ως προς τη συγκέντρωση της παραγόμενης γλυκόζης, της ποσοστιαίας μετατροπής της κυτταρίνης σε γλυκόζη, αλλά και των ολικών αναγωγικών σακχάρων για όλα τα προκατεργασμένα δείγματα βιομάζας. Στη συνέχεια, αξιοποιήθηκε για πρώτη φορά το στερεό κλάσμα δασικής βιομάζας για την παραγωγή D-γαλακτικού οξέος ως πηγή σακχάρων σε διεργασία ταυτόχρονης σακχαροποίησης και ζύμωσης (SSF), ύστερα από αριστοποίηση των συνθηκών ανάπτυξης και παραγωγής γαλακτικού οξέος από το συγκεκριμένο γαλακτοβακτήριο. Επιτεύχθηκαν υψηλές αποδόσεις D-γαλακτικού οξέος (μέγιστη: 62 g/L) με χαμηλό ενζυμικό φορτίο (9,6 FPU/g υποστρώματος) με ταυτόχρονη ελαχιστοποίηση των προϊόντων αποικοδόμησης των σακχάρων που δρουν παρεμποδιστικά. Επιπλέον, αξιοποιήθηκε και αναλύθηκε το υγρό κλάσμα της OxiOrganosolv προκατεργασίας προερχόμενο από δασική βιομάζα με υψηλή συγκέντρωση παραγόμενων ολιγοσακχαριτών (μέγιστη απόδοση: 98 mg/g αρχικής βιομάζας), υψηλό ποσοστό ακετυλιωμένων υποκαταστατών και χαμηλό ποσοστό παρεμποδιστών (10 mg/g ξυλο-ολιγοσακχαριτών). Τέλος, για πρώτη φορά αξιοποιήθηκε τόσο το στερεό όσο και το υγρό κλάσμα γεωργικής βιομάζας για την παραγωγή ω-3 λιπαρών οξέων από το συγκεκριμένο μικροφύκος με απόδοση 30% παραγόμενου DHA (22:6, ω-3, προϊόν ενδιαφέροντος) έναντι 70% των παραγόμενων ολικών λιπαρών οξέων (TFAs). Επιπρόσθετα, για πρώτη φορά αξιολογήθηκε η επίδραση των «πράσινων καταλυτών» POMs συνδυαστικά με την OxiOrganosolv προκατεργασία στο στερεό κλάσμα δειγμάτων δασικής προέλευσης σε καλλιέργειες με το συγκεκριμένο μικροφύκος για την παραγωγή ω-3 λιπαρών οξέων, όπου επιτεύχθηκαν υψηλές αποδόσεις.