Επίπτωση της λοίμωξης του Ελικοβακτηρίου του πυλωρού (Helicobacter pylori) στους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA

Abstract

Helicobacter pylori infection promotes chronic active gastritis and a plethora of DNA damages including strand breaks, microsatellite instability, epigenetic alterations, point and frameshift mutations. The gastric epithelial cells, in order to maintain genomic integrity, require an integrous DNA damage repair machinery which, however, has been reported to be modulated by the infection. CagA is a major H. pylori virulence factor that deregulates host cell functions such as inflammatory response, cell proliferation, apoptosis and genomic stability. Its pathogenic intracellular activity is partly regulated by hierarchical tyrosine phosphorylation at repeated EPIYA motifs by host kinases. The aim of this study was to identify putative effects of H. pylori infection and CagA protein on DNA damage repair machinery, investigating the transcriptome of AGS cells, infected with wild-type, ΔCagA and EPIYA-C phosphorylation-defective H. pylori strains. Upon RNA-Sequencing on polyA-selected transcripts we performed Differential Expression Analysis, Pathway Enrichment Analysis as well as visualization on KEGG Pathway Maps per DNA damage repair mechanism. Key components of DNA damage repair that were observed to be downregulated in a CagA-related manner were validated via Western blot utilizing AGS and the non-cancerous GES-1 cell lines. Moreover, the impact of H. pylori infection, as well as CagA expression, on genome integrity was assessed by utilizing Western blot for γH2AX and alkaline Comet assay.Transcriptome analysis revealed that a notable number of DNA damage repair genes were deregulated during H. pylori infection resulting to potential attenuation of Base Excision Repair and Mismatch Repair and a more intricate deregulation of Nucleotide Excision Repair and Homologous Recombination. CagA expression was observed to contribute to Nth Like DNA Glycosylase 1 (NTHL1), MutY DNA Glycosylase (MUTYH), Flap Structure-Specific Endonuclease 1 (FEN1), RAD51 Recombinase, DNA Polymerase Delta Catalytic Subunit (POLD1), and DNA Ligase 1 (LIG1) downregulation and, contrary to transcriptome results, Apurinic/Apyrimidinic Endodeoxyribonuclease 1 (APE1) upregulation. H. pylori infection was observed to induce the formation of DNA double strand breaks, as indicated by the induction of γH2AX, regardless of CagA expression, whereas CagA, in the context of the infection, is suggested to increase the overall formation of DNA strand breaks, apurinic/apyrimidinic sites, nicks and deoxyribose damage. This study accentuates the role of CagA, as a significant contributor of the H. pylori infection-mediated modulation of DNA damage repair, potentially disrupting the balance between DNA damage introduction and repair thus favoring genomic instability and contributing to gastric cancer development.

H λοίμωξη με Helicobacter pylori προωθεί την εμφάνιση χρόνιας ενεργού γαστρίτιδας και πληθώρας DNA βλαβών, συμπεριλαμβανομένων θραύσεων της αλυσίδας του DNA, μικροδορυφορική αστάθεια, επιγενετικές μεταβολές, πλαισιοτροποποιητικές και σημειακές μεταλλαγές. Τα γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα, προκειμένου να αποτρέψουν την εμφάνιση γενωμικής αστάθειας, απαιτούν την ακεραιότητα των μηχανισμών επιδιόρθωσης του DNA, οι οποίοι, ωστόσο, έχουν αναφερθεί πως επηρεάζονται από τη λοίμωξη. Η πρωτεΐνη CagA αποτελεί κύριο παράγοντα παθογένειας του H. pylori, ο οποίος απορρυθμίζει μια σειρά κυτταρικών διαδικασιών του ξενιστή όπως τη φλεγμονώδη απόκριση, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την απόπτωση και τη γενωμική σταθερότητα. Η παθογενής ενδοκυττάρια δράση της ρυθμίζεται, εν μέρει, από ιεραρχικές φωσφορυλιώσεις τυροσίνης σε επαναλαμβανόμενες αμινοξικές αλληλουχίες του τύπου EPIYA, από κινάσες του ξενιστή. Ο στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να αναγνωριστούν δυνητικές επιπτώσεις της H. pylori λοίμωξης και της πρωτεΐνης CagA στους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA. Για αυτό το σκοπό, μελετήθηκε το μεταγράφωμα κυττάρων AGS κατόπιν λοίμωξης με H. pylori στελέχη άγριου τύπου, ΔCagA αλλά και στελέχη με αδυναμία φωσφορυλίωσης της CagA στις καρβόξυ-τελικές αλληλουχίες EPIYA. Έπειτα από ανάγνωση της RNA αλληλουχίας (RNA-sequencing) σε polyA-επιλεγμένα μετάγραφα, πραγματοποιήθηκε Ανάλυση Διαφορικής Έκφρασης, Ανάλυση Βιολογικών Μονοπατιών καθώς και οπτικοποίηση των αποτελεσμάτων στους χάρτες μεταγωγής σήματος της KEGG ανά επιδιορθωτικό μηχανισμό του DNA. Κομβικά γονίδια της επιδιόρθωσης DNA που παρατηρήθηκαν μειορρυθμισμένα με CagA-σχετιζόμενο τρόπο, αναλύθηκαν περαιτέρω και σε επίπεδο πρωτεϊνικής έκφρασης με ανάλυση κατά Western, αξιοποιώντας τις γαστρικές επιθηλιακές κυτταρικές σειρές AGS και GES-1. Επιπροσθέτως, μελέτη για την επίπτωση της H. pylori λοίμωξης, καθώς και της έκφρασης της πρωτεΐνης CagA, στην ακεραιότητα του γενώματος πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αλκαλικής Comet assay και ανάλυσης της παραγωγής γH2AX με ανάλυση κατά Western. Η ανάλυση μεταγραφώματος αποκάλυψε πως ένας αξιοσημείωτος αριθμός γονιδίων της επιδιόρθωσης του DNA απορρυθμίζεται κατά τη H. pylori λοίμωξη, οδηγώντας δυνητικά σε εξασθένιση των μηχανισμών Επιδιόρθωσης Μέσω Εκτομής Βάσης και της Επιδιόρθωσης Αναντιστοιχίας και μιας πιο περίπλοκης απορρύθμισης των μηχανισμών της Επιδιόρθωσης Μέσω Εκτομής Νουκλεοτιδίου και Ομόλογου Ανασυνδυασμού. Η έκφραση της βακτηριακής πρωτεΐνης CagA παρατηρήθηκε ότι συμβάλει στη μειορρύθμιση των Nth Like DNA Glycosylase 1 (NTHL1), MutY DNA Glycosylase (MUTYH), Flap Structure-Specific Endonuclease 1 (FEN1), RAD51 Recombinase, DNA Polymerase Delta Catalytic Subunit (POLD1), και DNA Ligase 1 (LIG1) και, σε αντίθεση με τα δεδομένα μεταγραφώματος, στην αυξορρύθμιση της Apurinic/Apyrimidinic Endodeoxyribonuclease 1 (APE1). Επιπλέον, η H. pylori λοίμωξη παρατηρήθηκε να επάγει το σχηματισμό θραύσεων της διπλής έλικας του DNA, όπως καταγράφεται από την επαγωγή σχηματισμού γH2AX, ανεξάρτητα από την έκφραση της CagA. Ωστόσο, η πρωτεΐνη CagA, στο πλαίσιο της λοίμωξης, σύμφωνα με την ανάλυση Comet assay προτείνεται να προωθεί την αύξηση, ως σύνολο, του σχηματισμού απουρινικών/απυριμιδινικών σημείων, εγκοπών, αλλοιώσεων των βάσεων και θραύσεων της έλικας του DNA. Η παρούσα διατριβή αναδεικνύει το ρόλο της πρωτεΐνης CagA, ως σημαντικού παράγοντα της H. pylori-επαγόμενης απορρύθμισης της επιδιόρθωσης του DNA κατά τη λοίμωξη, διαταράσσοντας δυνητικά την ισορροπία μεταξύ εμφάνισης και επιδιόρθωσης των DNA βλαβών, ευνοώντας με αυτό το τρόπο την εμφάνιση γενωμικής αστάθειας και συνεισφέροντας στην ανάπτυξη γαστρικού καρκίνου.